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幽門螺旋桿菌(HP)核酸檢測試劑盒實驗步驟

來源:上海研啟生物科技有限公司   2022年07月29日 13:58  


【產品名稱】

商品名稱:幽門螺旋桿菌(HP)核酸檢測試劑盒(熒光 PCR 法)

Name Helicobacter Pylori Detection KitReal-Time PCR Method

【包裝規格】25T/盒、50T/

【預期用途】

本試劑盒適用于檢測水樣糞便,疑似污染的水、食物等樣本中的幽門螺旋桿菌,用于幽門螺旋桿菌感染的輔 助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術,設計一對幽門螺旋桿菌特異性引物,結合一條特異性探針,用熒光 PCR 技術對幽門螺旋桿菌的 DNA 進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規格

25T/

50T/

HP 反應液

500μL×1 

500μL×2 

酶液

25μL×1 

50μL×1 

HP 陽性質控品

50μL ×1 

50μL ×1 

陰性質控品

250μL ×1 

250μL ×1 

說明:不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20±5℃,避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次,有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005PLightCyclerBio-RadEppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

水樣便取 0.5~1mL;疑似污染的食物取 1g

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2~8℃條件下保存應不超過 24 h;若需長期保存,應放置-70℃以下保存,凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1. 樣品處理(樣本處理區)

1.1 樣本前處理

水樣便 13000rpm 離心 2min,去盡上清;疑似污染的食物用手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入1.5mL 生理鹽水后繼續研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μL  1.5mL 滅菌離心管中;疑似污染的水直接取 100μL 轉入 1.5mL 滅菌離心管中

1.2 核酸提取

采用核酸提取或純化試劑(磁珠法或離心柱法進行核酸提取請按照試劑說明書進行操作。

2. 試劑配制(試劑準備區)

根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 NN=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;反應管數每滿 10 份,多配制 1 ,每測試反應體系配制如下表:

試劑

HP 反應液

酶液

用量(樣本數為 N

19μL

1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,20μL/管。

3. 加樣(樣本處理區)

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL,分別加入相應的反應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

4. PCR 擴增(核酸擴增區)

4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;

4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL

熒光通道選擇:檢測通道(Reporter DyeFAM,淬滅通道(Quencher DyeNONEABI 系列儀器請勿選擇 ROX

參比熒光,選擇 None 即可。

 

4.3 推薦循環參數設置:

步驟

循環數

溫度

時間

收集熒光信號

1

1 cycle

95

2min

2

45 cycles

95

15sec

60

30sec

5. 結果分析判定

5.1 結果分析條件設定(請參照各儀器使用說明書進行設置,以分析 ABI7500  儀器為例)

反應結束后自動保存結果,根據分析后圖像調節 Baseline  Start  值、End  值以及 Threshold 值(用戶可根據實際情況自行調整,Start 值可設在 315End 值可設在 520,使閾值線位于擴增曲線指數期,陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線,點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2 結果判斷

陽性:檢測通道 Ct ≤40,且曲線有明顯的指數增長曲線; 陰性:樣本檢測結果 Ct >40 或無 Ct 值。

5.3 質控標準

陰性質控品:無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示;

陽性質控品:擴增曲線有明顯指數增長期,且 Ct ≤32 以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。

6. 檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;

3. 陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;

5. 不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;

6. 試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定量檢測不準確的結果;

7. 本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴格按照說明書進行;

2. 試劑盒內各種組分使用前應自然融化,*混勻并短暫離心;

3. 反應液應避光保存;

4. 反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服;

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

8. 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。

 


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