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ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題

來源:上海研啟生物科技有限公司   2022年07月27日 15:46  

ELISA是蛋白定量的金標(biāo)準(zhǔn),也是免疫學(xué)研究中-常用的實(shí)驗(yàn)方法之一。很多人覺得ELISA很簡單,其實(shí)不然。遠(yuǎn)慕生物帶你繞開ELISA實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的各種問題,輕松搞定ELISA實(shí)驗(yàn)~

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann,荷蘭學(xué)者VanWeerman和Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法,即酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。

酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)用于:

(1)免疫酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位;

(2)研究抗酶抗體的合成;

(3)顯現(xiàn)微量的免疫沉淀反應(yīng);

(4)定量檢測體液中抗原或抗體成份。

優(yōu)點(diǎn):快速、靈敏、定性、定量、定位

實(shí)驗(yàn)原理

1.包被:抗原/抗體,固相化

2.反應(yīng): 1)待測抗體/抗原; 2)酶標(biāo)抗原/抗體

3.洗滌:使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離

4.底物顯色:定性/定量分析

常用的酶與底物:

酶底物顯色測定波長

辣根過氧化物酶horseradish pero

xidase,HRP鄰苯二胺(OPD)橘紅色492nm

四甲基聯(lián)苯胺(TMB)黃色450nm

堿性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸鹽(p-NPP)黃色405nm

終止液:2mol/L  H2SO4

 常用方法

1.間接法

檢測抗體-常用的方法, 主要用于對病原體抗體的檢測。

優(yōu)勢:二抗可以加強(qiáng)信號,而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標(biāo)記的一級抗體則能保留它多的免疫反應(yīng)性。

缺點(diǎn):交互反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率較高

2.雙抗體夾心法

檢測大分子抗原-常用的方法。

優(yōu)勢:高靈敏、高專一性,抗原無須事先純化。

缺點(diǎn):抗原一定得擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位。

3.競爭法

檢測小分子半抗原(藥物、激素等)。

優(yōu)勢:可適用比較不純的樣本,而且數(shù)據(jù)再現(xiàn)性很高。

缺點(diǎn):整體的敏感性和專一性都較差。

常見問題分析

Q1.標(biāo)曲不顯色或顯色很弱,樣本顯色

溶解標(biāo)準(zhǔn)品以及倍比稀釋時(shí),未渦旋震蕩或不夠充分。

標(biāo)準(zhǔn)品溶解、倍比稀釋時(shí)均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反復(fù)吹打,效率較低、效果也不一定-佳。

 Q2.標(biāo)曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上,這樣非常不利于抗原抗體之間的充分接觸,導(dǎo)致顯色偏弱。

 推薦孵育階段,使用ELISA的微孔板振蕩器,調(diào)至合適的頻率,使抗原抗體充分接觸,保證結(jié)合效果。如果排除上述原因,有可能是漏加了某個(gè)組分,如檢測抗體、酶等。對于比較馬虎的新手,一定要做好標(biāo)記和記錄,或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

 Q3.標(biāo)曲顯色,樣本不顯色

當(dāng)樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強(qiáng),就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度-高的方法,與不同技術(shù)結(jié)合后,衍生出了多種類型的ELISA,提高了檢測靈敏度。

對于目的蛋白濃度特別低的樣本,可以嘗試用高敏ELISA,但這也并不意味著一定能檢測到樣本濃度,只能說可以提高樣本的可測率,并使結(jié)果更加可靠。因?yàn)橥ǔS闷胀‥LISA檢測的樣本OD值都偏低,而高敏ELISA可提高樣本OD值,使之盡量位于標(biāo)曲范圍內(nèi),得到的數(shù)值也更加可信。

 Q4.標(biāo)曲和樣本都顯色,但復(fù)孔的CV大

這個(gè)問題就跟移液器和實(shí)驗(yàn)者的操作有關(guān)了。移液器的使用維護(hù)不規(guī)范,就會(huì)造成移液的誤差較大;實(shí)驗(yàn)者自身的操作習(xí)慣、加樣的一致性對復(fù)孔的CV也有很大影響。

掌握移液器的正確使用和維護(hù)。關(guān)于個(gè)人的操作可練習(xí)移液動(dòng)作、加快速度,確保移液的精密度。

Q5.本底偏高,樣本值測不到

標(biāo)曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對于高敏ELISA可以適當(dāng)放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時(shí)候,本底過高會(huì)掩蓋目的信號,導(dǎo)致無法測到樣本值。

 在加入TMB顯色后,需實(shí)時(shí)觀察標(biāo)曲顯色-情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍(lán)色,即可終止反應(yīng)。

 Q6.樣本經(jīng)不同梯度稀釋,計(jì)算得到的樣本值差異較大

有時(shí)候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何,應(yīng)該如何稀釋,那么我們就會(huì)做下預(yù)實(shí)驗(yàn),確定稀釋倍數(shù)。然而有時(shí)候同一樣本做了幾個(gè)不同梯度稀釋后,計(jì)算得到的樣本值之間差異較大,應(yīng)該選擇哪一個(gè)稀釋倍數(shù)呢?

 這里涉及到了基質(zhì)效應(yīng)。通常血清樣本加樣量較高時(shí),血清中的各種蛋白會(huì)抑制抗原抗體的接觸,基質(zhì)效應(yīng)較明顯。而經(jīng)過稀釋后,干擾因素也隨之稀釋,影響就會(huì)較小。當(dāng)某兩個(gè)梯度稀釋后,計(jì)算得到的樣本值接近時(shí),我們就可以認(rèn)為在該稀釋梯度時(shí),樣本中的干擾因素影響較小,計(jì)算得到的值也是接近真實(shí)的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對于濃度很低的樣本,經(jīng)過多倍稀釋后,就更加測不到了,此時(shí)可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。

 Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

除非是公用的試劑如洗液、檢測緩沖液,其它組分不建議用其它試劑盒的組分,甚至是同一指標(biāo)不同批次的試劑盒里的組分。這些組分(包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經(jīng)過優(yōu)化的,如果貿(mào)然使用其它試劑盒的組分,有可能對結(jié)果產(chǎn)生影響
 

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