手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
細胞遺傳學分析中淋巴細胞微核測定方法介紹
淋巴細胞微核測定是細胞遺傳學分析中常用的方法之一,通過微核率的高低可以有效判斷染色體畸變率與輻射損傷。
一、淋巴細胞分離
分離使用Ficoll-Paque密度梯度分離淋巴細胞。將血液用磷酸鹽緩沖鹽水按 1:1 稀釋，并在 Ficoll-Paque 上分層，血液 + PBS: Ficoll 的比例保持為 4:3。血液在室溫下以 1800 rpm 離心 35 分鐘。去除淋巴細胞層（血沉棕黃層）并在 PBS 中以 1200 rpm 洗滌兩次，每次 10 分鐘，然后用培養基 RPMI 1640 洗滌。用血細胞計數器計數細胞密度。
二、培養條件
淋巴細胞在 15 ml 錐形聚苯乙烯離心管中的 5% CO2 加濕培養箱中于 37o 培養。通常，每個培養物由 2 毫升培養基中的 1x10 6 個細胞的初始密度組成。培養基由補充有 10% 胎牛血清 2mM L-谷氨酰胺、100 單位/ml 青霉素、100 ug/ml 鏈霉素和 1.5% 植物血凝素的 RPMI 1640 組成。
在起始后 44 小時將微核測定細胞松弛素 B 加入到培養物中。細胞松弛素 B 阻止細胞完成胞質分裂，導致多核細胞的形成。細胞培養物中細胞松弛素 B 的最終濃度為 3 mg/ml。
在培養開始后 72 小時，使用細胞離心機 (Shandon, Sewickley, PA) 將淋巴細胞直接離心到載玻片上。然后將細胞以 600 rpm 的速度旋轉到載玻片上 10 分鐘。在室溫下甲醇固定 15 分鐘之前，讓載玻片風干。載玻片在-20℃ 下儲存在密封盒中，在 N2 下干燥。
三、細胞染色與微核測定
染色：將甲醇固定的載玻片在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中孵育 5 分鐘。從載玻片中排出多余的液體，并用含有 0.2% Tween 20 的 PBS 1:1 稀釋 40-50 ul 抗動粒抗體應用% Tween 20。然后將載玻片蓋上蓋玻片并置于 37oC 的加濕室中 1 小時。在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中洗滌兩次，每次 5 分鐘后，再次排出多余的液體，用 1:50 稀釋的熒光山羊抗人 IgG覆蓋載玻片并再次孵育 1 H。因為熒光標記的抗體暴露在光線下會褪色，此步驟和所有后續步驟應在黃燈下進行。將載玻片在加 0.1% Tween 20 的緩沖液中沖洗兩次，并在抗褪色溶液中用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (2 ug/ml) 復染。
對于淋巴細胞微核測試，對 1000 個雙核淋巴細胞（那些經歷了一次有絲分裂分裂的細胞）進行檢測，每個重復培養物中的 500 個細胞，用于計算微核的數量。通過切換到熒光濾光片來確定動粒點的存在與否。
檢測標準如下：
1) 細胞應具有完整的細胞質的圓形或橢圓形外觀
2) 細胞核應同樣為圓形或橢圓形，具有完整的核膜
3) 只有經歷過一次核分裂的細胞才應檢測微核的存在
4) 僅當微核大小為主核的三分之一或以下時才應計數
5) 微核的染色應與主核相似
6) 微核應與主核明顯分開。
復制指數 (RI)，細胞分裂動力學的量度，通過計算每個樣本 400 個總細胞中含有 1、2、3 或更多細胞核的細胞百分比，從對微核進行檢測的相同載玻片上進行檢測。
復制指數RI 計算如下：
RI = (1x% 單核細胞) + (2x% 雙核細胞) + (3x% tri) + (4x% 四核細胞）……
一、淋巴細胞分離
分離使用Ficoll-Paque密度梯度分離淋巴細胞。將血液用磷酸鹽緩沖鹽水按 1:1 稀釋，并在 Ficoll-Paque 上分層，血液 + PBS: Ficoll 的比例保持為 4:3。血液在室溫下以 1800 rpm 離心 35 分鐘。去除淋巴細胞層（血沉棕黃層）并在 PBS 中以 1200 rpm 洗滌兩次，每次 10 分鐘，然后用培養基 RPMI 1640 洗滌。用血細胞計數器計數細胞密度。
二、培養條件
淋巴細胞在 15 ml 錐形聚苯乙烯離心管中的 5% CO2 加濕培養箱中于 37o 培養。通常，每個培養物由 2 毫升培養基中的 1x10 6 個細胞的初始密度組成。培養基由補充有 10% 胎牛血清 2mM L-谷氨酰胺、100 單位/ml 青霉素、100 ug/ml 鏈霉素和 1.5% 植物血凝素的 RPMI 1640 組成。
在起始后 44 小時將微核測定細胞松弛素 B 加入到培養物中。細胞松弛素 B 阻止細胞完成胞質分裂，導致多核細胞的形成。細胞培養物中細胞松弛素 B 的最終濃度為 3 mg/ml。
在培養開始后 72 小時，使用細胞離心機 (Shandon, Sewickley, PA) 將淋巴細胞直接離心到載玻片上。然后將細胞以 600 rpm 的速度旋轉到載玻片上 10 分鐘。在室溫下甲醇固定 15 分鐘之前，讓載玻片風干。載玻片在-20℃ 下儲存在密封盒中，在 N2 下干燥。
三、細胞染色與微核測定
染色：將甲醇固定的載玻片在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中孵育 5 分鐘。從載玻片中排出多余的液體，并用含有 0.2% Tween 20 的 PBS 1:1 稀釋 40-50 ul 抗動粒抗體應用% Tween 20。然后將載玻片蓋上蓋玻片并置于 37oC 的加濕室中 1 小時。在含有 0.1% Tween 20 的 PBS 中洗滌兩次，每次 5 分鐘后，再次排出多余的液體，用 1:50 稀釋的熒光山羊抗人 IgG覆蓋載玻片并再次孵育 1 H。因為熒光標記的抗體暴露在光線下會褪色，此步驟和所有后續步驟應在黃燈下進行。將載玻片在加 0.1% Tween 20 的緩沖液中沖洗兩次，并在抗褪色溶液中用 4'6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (2 ug/ml) 復染。
對于淋巴細胞微核測試，對 1000 個雙核淋巴細胞（那些經歷了一次有絲分裂分裂的細胞）進行檢測，每個重復培養物中的 500 個細胞，用于計算微核的數量。通過切換到熒光濾光片來確定動粒點的存在與否。
檢測標準如下：
1) 細胞應具有完整的細胞質的圓形或橢圓形外觀
2) 細胞核應同樣為圓形或橢圓形，具有完整的核膜
3) 只有經歷過一次核分裂的細胞才應檢測微核的存在
4) 僅當微核大小為主核的三分之一或以下時才應計數
5) 微核的染色應與主核相似
6) 微核應與主核明顯分開。
復制指數 (RI)，細胞分裂動力學的量度，通過計算每個樣本 400 個總細胞中含有 1、2、3 或更多細胞核的細胞百分比，從對微核進行檢測的相同載玻片上進行檢測。
復制指數RI 計算如下：
RI = (1x% 單核細胞) + (2x% 雙核細胞) + (3x% tri) + (4x% 四核細胞）……
蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司為您提供的生物反應器產品廣泛應用于抗體蛋白生產工藝、新藥開發、科學研究等領域。罐體容量具有多種規格可供選擇，以實現靈活的多產品操作，滿足不同用戶需求，提高制造設施的利用率。針對特殊用戶，還可以定制大型不銹鋼發酵罐，細胞生物反應器。生物反應器采用PLC系列控制系統穩定、可靠。并針對特定細胞系自動優化混合和傳質，使設備在有限空間內實現高效、高產能要求。
以USB一次性生物反應器為例，可提供高達 2,000L Vw 的生物反應器容積、高達 1,000L Vw 的發酵罐容積，并且符合 cGMP 、GMP質量驗證要求，成為新藥研發企業和抗體藥物生產等制藥工程工藝中的重要工具，滿足不同級別細胞培養工藝放大需求。
為了進一步確保穩健的供應鏈，楚怡擁有多條生產線，以供產品設備生產，提供較短的交貨期和供應冗余。生物反應器、發酵罐罐體容器、管道系統均采用經過行業驗證的產品接觸不銹鋼材料制成，同時為用戶提供專車運輸、設備安裝、生產操作指導、工藝技術輔助，配件供應等售后服務。
相關產品
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
采購中心