生物藥物雜質(zhì)可以分為外來污染物和與產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)兩大類，其中外來污染物包括微生物污染、熱原、細(xì)胞成分、培養(yǎng)基中的成分、來自生產(chǎn)過程中各步驟的物質(zhì)以及來自純化步驟的物質(zhì)等等。各種雜質(zhì)和數(shù)量會影響最終藥品的安全性，在其開發(fā)過程中對雜質(zhì)的鑒別、定量、定性和控制以及去除是非常重要的。

今天小編總結(jié)了部分相關(guān)雜質(zhì)檢測，涉及抗體藥研發(fā)，細(xì)胞治療和mRNA疫苗等研究領(lǐng)域，敲黑板，做筆記嘍...

①雙鏈RNA(dsRNA)殘留檢測；
②宿主DNA殘留檢測；
③Protein A 檢測；
④BSA殘留檢測；
⑤CHO宿主蛋白（HCP）殘留檢測；
⑥E.coli大腸桿菌宿主蛋白（HCP）殘留檢測

dsRNA殘留
在基于酶反應(yīng)制備mRNA疫苗的過程中，異常的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（In vitro transcribed ，IVT）也可能會引入dsRNA污染物。相較于病毒來源的dsRNA，體外反應(yīng)中生成的dsRNA污染的檢測和去除對于RNA疫苗更為重要。混入了dsRNA污染的IVT mRNA會引起強(qiáng)烈的I型干擾素介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)，上調(diào)PKR和OAS等關(guān)鍵酶的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞翻譯水平的抑制和細(xì)胞內(nèi)mRNA和核糖體RNA的降解。相應(yīng)的，引入能高效去除dsRNA污染的FPLC純化過程，能在原代人DC細(xì)胞中1000倍提升IVT mRNA介導(dǎo)的蛋白表達(dá)。因此，mRNA疫苗生產(chǎn)過程中合適、有效的IVT mRNA純化對于DC細(xì)胞抗原蛋白的生產(chǎn)非常關(guān)鍵，并能避免不必要的自身免疫反應(yīng)的激活。

均相時間分辨熒光（TR-FRET）技術(shù)使用雙抗夾心法檢測dsRNA，是替代ELISA和qPCR的一種快速，高靈敏的檢測方法。實驗全程無洗滌，實現(xiàn)均相二步法檢測。該技術(shù)凝聚了時間分辨（TRF）和熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）兩大技術(shù)核心，實現(xiàn)檢測背景低，高通量，高特異性，高靈敏度，除技術(shù)優(yōu)勢外，還具有高性價比，現(xiàn)已受到國際和國內(nèi)眾多mRNA研究客戶認(rèn)可。

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宿主細(xì)胞DNA殘留
生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的動物細(xì)胞株表達(dá)生產(chǎn)，雖然經(jīng)過嚴(yán)格的純化工藝，但產(chǎn)品中仍有可能殘余宿主細(xì)胞DNA。病毒性疫苗中宿主細(xì)胞殘留DNA相關(guān)的風(fēng)險主要是感染性和致癌性，如果存在逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒，其基因整合入受者基因組可能導(dǎo)致感染；如果存在病毒或傳代細(xì)胞基質(zhì)中的致癌基因，則可能具有引發(fā)腫瘤的潛在風(fēng)險。因此，建立合適的宿主細(xì)胞殘留DNA的檢測方法對監(jiān)測生物制品的安全性和質(zhì)量可控性至關(guān)重要。

LANCE技術(shù)用于分析檢測和定量緩沖溶液和細(xì)胞培養(yǎng)基中的DNA污染物，利用鑭系元素Eu和APC ULight分別作為熒光能量供體和受體，實現(xiàn)熒光定量檢測。該技術(shù)全程無需洗滌和包被，實驗背景低，檢測下限54.5 pg/mL，檢測范圍：54.5– 30,000 pg/mL。EC50: 50.1 ng/mL。

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Protein A殘留
Protein A親和層析在反復(fù)使用過程中會產(chǎn)生一定程度的脫落，殘留在產(chǎn)品中的Protein A會引起不良免疫應(yīng)答反應(yīng)，其和抗體的復(fù)合物在體內(nèi)可激活攜帶Fc的白細(xì)胞和補(bǔ)體系統(tǒng)的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生氧化和過敏反應(yīng)，一般采用離子交換層析可以去除。美國FDA建議產(chǎn)品中Protein A殘留應(yīng)低于10-12ppm。

針對生物工藝中經(jīng)親和柱分離純化后的藥物產(chǎn)品，該試劑盒可以快速簡便的測定其中是否含有Natural Protein A from S. aureus (Millipore)，Recombinant Protein A from E. coli (Repligen)，Recombinant Cys-Protein A from E. coli (GE)，Recombinant alkaline-resistant Protein A variant from E. coli (MabSelectSure™）from GE 以及對應(yīng)的含量。

Enzo ELISA檢測Protein A靈敏度可達(dá)9.01 pg/ml (<1 ppm)。3小時內(nèi)完成檢測。可檢測多品牌來源的Protein A，價格遠(yuǎn)低于同類產(chǎn)品。在國內(nèi)已經(jīng)擁有大量CDMO，藥物研發(fā)公司類型用戶。

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BSA殘留
生產(chǎn)生物制劑經(jīng)常需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，牛血清白蛋白(BSA)被用作細(xì)胞和微生物培養(yǎng)中的一種營養(yǎng)物質(zhì)。大量的牛血清白蛋白在生產(chǎn)過程中通過洗換、純化等步驟去除了大部分的BSA，但微量的BSA依然存在于生物制劑成品中。BSA作為異種蛋白進(jìn)入人體后有可能引起嚴(yán)重過敏反應(yīng)，影響生物制品的安全性。因此，嚴(yán)格控制制品中BSA的含量是生物制品生產(chǎn)的重點工作之一。除了疫苗之外，細(xì)胞治療、干細(xì)胞以及組織工程產(chǎn)品等生物制劑也會進(jìn)行BSA殘留量的檢測，保證相關(guān)生物制品的安全性。《中國藥典》（三部）2020版對各種疫苗BSA的殘留量都進(jìn)行了明確的規(guī)定，基本是不高于50 ng/ml。

Bethyl ELISA檢測BSA試劑盒采用經(jīng)典酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，特異性高，檢測范圍為0.69–500 ng/ml。

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CHO宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留
宿主細(xì)胞蛋白（HCP）是與過程相關(guān)的雜質(zhì)，由用于生產(chǎn)生物藥物蛋白的宿主細(xì)胞表達(dá)。在純化過程中，大部分的HCP被去除（> 99％），但殘留的HCP量仍保留在分布的產(chǎn)品中，例如單克隆抗體（mAb）、抗體-藥物結(jié)合物（ADC）、治療性蛋白質(zhì)、疫苗，以及其他基于蛋白質(zhì)的生物制藥。諸如FDA和EMA之類的國家法規(guī)授權(quán)要求必須對生物藥品進(jìn)行分析和純化，以將宿主細(xì)胞蛋白HCP降低到可接受的水平。如美國藥典推薦值：終產(chǎn)品的HCP水平1-100 ng/mg。中國藥典各論中，CHO細(xì)胞HCP應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.05% 。

均相時間分辨熒光技術(shù)檢測宿主細(xì)胞蛋白殘留靈敏度比傳統(tǒng)ELISA高2-5倍的檢測方法。檢測下限可達(dá)0.8 ng/ml，檢測范圍6.25-400ng/ml，批間差異小，CV值小于10%。稀釋線性好，回收率高于98%等優(yōu)勢。

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大腸桿菌宿主蛋白殘留
大腸桿菌是應(yīng)用廣泛，成功的表達(dá)體系，因此大腸桿菌常被用于重組蛋白生產(chǎn)、基因治療、細(xì)胞治療以及近幾年非常火熱的mRNA疫苗生產(chǎn)等。中國藥典各論中，E.coli菌體HCP應(yīng)不高于蛋白質(zhì)總量的0.10% 。大腸桿菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的HCP受到菌株背景、細(xì)胞培養(yǎng)條件和重組藥物等因素影響，目前沒有一個通用試劑盒能夠覆蓋到到每個HCP檢測。

Biogenes大腸桿菌360-HCP ELISA通過不同的抗HCP抗體提供更高特異性和靈敏度，分為四種試劑盒類型（A型，C型，D型，E型），用于優(yōu)化HCP檢測。區(qū)別為大腸桿菌抗原遺傳背景：BL21（DE3）和W3110和培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基和礦物培養(yǎng)基。

由于難以預(yù)測大腸桿菌中的HCP譜，我們建議首先測試所有四種試劑盒類型，然后根據(jù)ELISA關(guān)鍵參數(shù)（如稀釋線性，準(zhǔn)確性和覆蓋率）選擇性能最佳的試劑盒。

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