1.  預變性（Initial denaturation）

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關重要，建議加熱時間參考試劑說明書，一般未修飾的Taq酶激活時間為兩分鐘。

2.  循環中的變性步驟

循環中一般95℃，30秒足以使各種靶DNA序列*變性，可能的情況下可 縮短該步驟時間，變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不*，易造成擴增失敗。

3.  引物退火（Primer annealing）

退火溫度需要從多方面去決定，一般根據引物的Tm值為參考，根據擴增的長度適當下調作為退火溫度。然后在此次實驗基礎上做出預估。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

4.  引物延伸

引物延伸一般在72℃進行（Taq酶最適溫度）。但在擴增長度較短且退火溫度較高時，本步驟可省略

延伸時間隨擴增片段長短而定，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設定為1 min/kbp。

5.  循環數

大多數PCR含25-40循環，過多易產生非特異擴增。

6.  最后延伸

在最后一個循環后，反應在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸*，并使單鏈產物退火成雙鏈。