雙抗體夾心法檢測抗原

雙抗體夾心法是檢測抗原常用的方法，但要注意的是在一步法（待測抗原與酶標抗體一起加入反應）測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成“夾心復合物”出現鉤狀效應，甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

雙抗體夾心法的簡要操作步驟為：
1）先加入抗體，使抗體固定結合于載體表面；
2）再加樣品，使目標檢測抗原形成抗原-抗體復合物；
3）加酶標抗抗體（第二種動物抗抗原的酶標抗體）；
4）加入酶促反應底物，發生顯色反應，顯色的深淺與待測抗原的量成正比。

競爭法檢測抗原

當小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的抗體結合位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。方法的基本原理可見圖2，經洗滌后分成兩組：一組加酶標記抗原和被測抗原的混合液，而另一組只加酶標記抗原，再經孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測定的未知抗原的量。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

競爭法的簡要操作步驟：
1）先加入抗體，使抗體固定結合于載體表面；
2）加入梯度濃度比例的待測樣品與酶標抗原混合物,同時做只加酶標抗原的對照組；
3）加入酶促反應底物，發生顯色反應，對比實驗組及對照組的顯色差異，計算未知抗原的量。

雙抗原夾心法檢測抗體

雙抗原夾心法的反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采用本法。本法關鍵在于酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

雙抗原夾心法的簡要操作步驟為：
1）先加入抗原，使抗體固定結合于載體表面；
2）再加樣品，使目標檢測抗體形成抗原-抗體復合物；
3）加酶標抗原；
4）加入酶促反應底物，發生顯色反應，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。

間接法檢測抗體

間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（辣根過氧化物酶標記的兔抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體（人免疫球蛋白），故稱為間接法。本法主要用于對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

間接法的簡要操作步驟：
1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原；
2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗-體復合物；
3）加酶標抗抗體；
4）加入酶促反應底物，發生顯色反應，顯色的深淺與待測抗體的量成正比。