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厭氧菌的分離培養主要分初代培養和次代培養兩個階段，其中初代培養相對比較困難，的問題就是厭氧環境和培養基的選擇。
初代培養的一般原則是：
（1）先將標本涂片染色直接鏡檢，指導培養基的選擇。
（2）盡量選用在厭氧菌中覆蓋面寬的非選擇性培養基。
（3）好多選1～2種覆蓋面不同的選擇性培養基。
（4）盡量保證培養基新鮮。
（5）要考慮到微需氧菌存在的可能。
1.選用適當的培養基接種：應接種固體和液體兩種培養基；
（1）培養基的使用，應注意下列各點：
1）盡量使用新鮮培養基，2～4h內用完；
2）應使用預還原培養基，預還原24～48h更好；
3）可采用預還原滅菌法制作的培養基（用前于培養基中加入還原劑，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸鈉、維生素C及葡萄糖等，盡可能使預還原劑處于還原狀態）；
4）液體培養基應煮沸10min，以驅除溶解氧，并迅速冷卻，立即接種；
5）培養厭氧菌的培養基均應營養豐富，并加有還原劑與生長刺激因子（血清、維生素K、氯化血紅素、聚山梨酯-80等）。
（2）培養基的選擇：初次培養一般都使用選擇培養基和非選擇培養基。
1）非選擇培養基：本培養基使分離的厭氧菌不被抑制，幾乎能培養出所有的厭氧菌。常使用心腦浸液瓊脂（BHI）、布氏瓊脂（BR）、胰豆胨肝粉瓊脂（GAM）、胰胨酵母瓊脂（EG）、CDC厭氧血瓊脂等。
2）選擇培養基：為有目的選擇常見厭氧菌株，以便盡快確定厭氧的種類。
2.每份標本少接種3個血平板，分別置于有氧，無氧及5%～10à2環境中培養，以便正確地培養出病原菌，從而判斷其為需氧菌、兼性厭氧菌、微需氧菌或厭氧菌中的哪一類。
3.厭氧培養法
（1）厭氧罐培養法。
（2）氣袋法。
（3）氣體噴射法：又稱轉管法。
（4）厭氧手套箱培養法：是迄今厭氧菌培養的佳儀器之一。
（5）其他培養法：平板焦性沒食子酸法醫學教育網搜集|整理；生物耗氧法；高層瓊脂培養法。
4.厭氧狀態的指示：美藍和刃天青。無氧時均呈白色，有氧時美藍呈藍色，刃天青呈粉紅色。
5.分離培養厭氧菌失敗的原因：①培養前未直接涂片和染色鏡檢；②標本在空氣中放置太久或接種的操作時間過長；③未用新鮮配制的培養基；④未用選擇培養基；⑤培養基未加必要的補充物質；⑥初代培養應用了硫乙醇酸鈉作為厭氧菌培養基；⑦無合適的厭氧罐或厭氧裝置漏氣；⑧催化劑失活；⑨培養時間不足；⑩厭氧菌的鑒定材料有問題。
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