由Equine Racing Co.，Ltd.的*執行官Masaru Sese先生提供

1.簡介

在法醫學領域，除尿液作為藥物測試樣品外，毛發樣品也在不斷引起研究者注意。由于通常藥物作為尿代謝產物接收檢測時，如果沒能在藥物清除前采集到尿液樣品，就無法檢測出來。而毛發中的藥物則不會代謝掉，并且停留時間很長。換言之，尿液中的藥物可能會在后一次攝入后幾天內，由于代謝和排泄的關系排除體外，而毛發樣品的特點在于只要不修剪，即可長期保留攝入歷史。

目前，已將氣相色譜質譜（GC-MS）和液相色譜質譜（LC-MS）等常規手段作為檢測毛發樣品的新方法，投入實際使用。采集的毛發經洗滌、干燥后，切割為約5mm至1cm長度，經提取、純化后，進行分析。人類毛發平均每月增長1cm，如果可以確定所測毛發的位置，即可確定“何時使用過藥物”、“使用過何種藥物”以及“用量多少”。請關注Ono、Mizuno 等人的文獻，該文獻作為法醫學領域的毛發分析提供參考，包括上述樣品預處理方法(1) - (3)。

當前此類毛發分析方法不僅在人來源樣品，同時在賽馬藥物檢測領域引起了關注(4)(5)。迄今報告用于馬毛分析的測試樣品均來自馬鬃毛（以下簡稱“馬毛”）。但是，馬毛通常較長，需要充分洗滌和干燥來去除樣品表面的污染物。另外，由于切割后所得樣品數量很多，前處理過程也會十分麻煩。

鑒于此，目前除GC-MS或LC-MS方法以外，已有報道使用質譜成像（MSI）技術進行毛發分析的新方法。利用MSI，經預處理的毛發樣品可被直接分析。近年來，Kamata等發表使用MSI檢測人類毛發中藥物攝入史的開創性論文(6) (7)。使用MSI檢測毛發中的藥物攝入史，則必須沿縱向去除毛發角質層，露出髓質。該過程十分困難，因此如參考文獻6所述，盡管制造用裝置進行該步驟，依然無法去除長度超過約1-2cm的角質層。與人的毛發不同，馬的鬃毛很長，從而導致這一過程變得更加麻煩，因此目前尚未有在馬毛中進行檢測藥物攝入的報道。本文將介紹使用MSI技術檢測馬毛中甾體抗炎藥磷酸地塞米松的應用實例，該馬毛樣品長4cm，經手動方式去除角質層。

2.質譜成像

在質譜分析時，分子被離子化，根據其在電場和磁場中的位移差來測量其質量（實際為m/z值，將質量除以離子所帶電荷數）。如前所述，MSI與使用現有GC-MS和LC-MS方法的不同之處在于，無需進行提取，可直接分析樣品表面，獲得待測藥物空間分布信息。

通常的實驗步驟包括準備樣品切片，并將其放置在ITO導電玻璃上。隨后樣品被電離并進行質譜分析。在分析時，確定樣品檢測區域和測量點間的間隔，獲取每個測量點的質譜圖及對應位置信息。獲取所有測量點質譜圖后，選擇與目標分子對應的m/z，并根據其強度分布獲得目標分子的定位信息。與常規成像技術不同，IMS不需要進行免疫化學染色或GFP標記等。由于直接獲得分子量信息，可區分目標化合物的原型及其代謝物；由于能夠同時電離多種化合物并進行質譜檢測，可在一次分析中獲得多種不同物質的定位信息。

3.iMScope TRIO的開發理念

目前，可以在多種質譜儀上進行MSI實驗，可選擇的離子源以及質譜種類也是各種各樣。自2004年以來，作者與島津株式會社(8)合作開發iMScope TRIO™成像質譜顯微鏡，目前正在大阪大學島津分析創新研究實驗室(9)進行各種相關應用研究。

iMScope TRIO的開發理念如圖1所示。盡管普通顯微鏡可以觀察組織結構，但很難獲取相關各種組分的信息。另一方面，iMScope TRIO將對樣品的顯微觀察和基質輔助激光解吸電離（MALDI）技術相結合從而進行成像質譜分析。

圖1 iMScope TRIO™成像質譜顯微鏡的理念

使用常規顯微鏡，可區分樣品結構上的差異，但是難以獲取相關化學成分的信息。相比之下，iMScope TRIO™可同時進行光學顯微觀察和質譜檢測，獲得對應組分的強度分析信息。

4.實驗方法

圖2 本研究中使用的分析設備

（A）iMLayer™：基質升華儀，（B）iMScope TRIO ™：成像質譜檢測，以及（C）iMScope TRIO ™系統的示意圖。該系統在大氣壓下進行樣品的顯微鏡觀察，并使用MALDI電離方式，生成的離子引入離子阱并由飛行時間質譜儀進行檢測。

本研究使用iMLayer™基質升華儀進行MALDI基質涂敷（圖2（A））。所用基質為α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-CHCA，Merck）和9-氨基吖啶（9-AA，東京化學工業有限公司），分別用于正離子模式分析和負離子模式分析，通過iMLayer在樣品表面上涂敷厚度為0.5 μm的基質。正離子模式分析中，基質升華后，使用噴槍手動噴涂α-CHCA溶液（10   mg/ml，使用30％乙腈/0.1%甲酸溶液）(10)。負離子模式分析中，9-AA升華后，將5％的甲醇蒸氣噴覆于樣品表面3秒鐘，進行重結晶(11)。

使用iMScope TRIO進行檢測（圖2（B），（C））。如上所述，iMScope TRIO配有光學顯微鏡，可在大氣壓下獲得樣品表面圖像，同時配置大氣壓MALDI離子源。MALDI所用激光器為Nd:YAG激光器，頻率為1 kHz。在大氣壓下產生的離子通過差級真空系統導入質量分析單元，并由離子阱飛行時間質譜儀檢測。質量范圍（m/z）在   50-3000之間，本次目標藥物磷酸地塞米松為小分子藥物，質量范圍設定至m/z 1000。

圖3（A）分析流程和（B）馬毛表皮去除方法

在立體顯微鏡下使用冷凍切片機刀片去除角質層，暴露出髓質

圖3（A）顯示該樣品的的分析流程。基本過程：采集馬毛、去除角質層、涂覆基質、使用iMScope TRIO檢測成像。用浸有蒸餾水的布擦拭所采集每一束馬毛的表面。該方式僅針對MSI可行，因為MSI無需提取即可直觀分析樣品。相反，在已有方法中，如清洗不充分，在提取過程中會發生污染問題。清潔馬毛表面后，立即干燥馬毛。將干燥后的馬毛固定于黏貼導電雙面膠帶的ITO載玻片（Matsunami Glass Ind.，Ltd.）上，并使用切片刀在立體顯微鏡下從毛囊末端開始去除角質層，如圖3（B）所示。由于馬毛的直徑約為人類毛發直徑的兩倍（約200μm），因此即使通過手動操作，也可輕松去除表面。除去角質層后，將剩余附著于ITO玻璃載玻片上的毛發作為待測樣品，涂覆基質并進行檢測。

本研究所使用藥物為地塞米松磷酸鈉（DexaSP），為一類甾體類抗炎藥。DexaSP可使用9-AA基質直接以負離子模式進行檢測?；蛘?，通過用吉拉德T試劑（GirT）對DexaSP進行衍生化，提高正離子模式的離子化效率（圖4）⁽¹²⁾。

圖4 地塞米松磷酸鈉（DexaSP）是靶向藥物

如進行正離子模式檢測，將以Gir T試劑作為衍生試劑生成的DexaSP衍生物作為檢測目標。

對于負離子模式檢測，將無變化的DexaSP作為檢測目標。

5.結果

圖5顯示使用標準品在正離子模式和負離子模式獲得的檢測結果。

圖5標準品的檢測結果

正離子模式和負離子模式均可獲得信號，但考慮前處理的簡便性和離子強度的差異，選擇負離子模式進行檢測。

如前所述，在正離子模式檢測中，將GirT衍生后的DexaSP衍生物作為檢測目標，而在負離子模式檢測中，將無變化DexaSP作為檢測目標。正離子模式下， 使用α-CHCA   檢測，DexaSP衍生物的質荷比為m/z   586.267，對應[GirT-DexaSP-2Na + 2H] +離子。另一方面，負離子模式中，使用9-AA檢測， [DexaSP-H]- 的質荷比為m/z 471.160。

兩種模式下均觀察到DexaSP由來的峰，但鑒于前處理所需時間且負離子模式強度約高出正離子模式100倍，決定使用9-AA在負離子模式下對馬毛進行檢測。

分析可疑馬毛樣本時，需進行對照實驗，檢測未給予DexaSP的馬毛樣品，確認沒有m/z 471.160離子的出現（圖6（A））。圖6（B）顯示地塞米松磷酸酯給藥后馬毛的質譜成像結果。

圖6馬毛中DexaSP分布檢測結果

（A）是未給藥馬匹的馬毛檢測結果，作為陰性對照；（B）給藥后馬匹的馬毛中檢測結果（注射15-20 mL由Fujita Pharmaceutical Co.提供的0.1％地塞米松磷酸鈉水溶液，濃度1.315 mg/mL， 連續注射3天）。用iMScope TRIO™掃描從毛囊開始4 cm長度的馬毛樣本，記錄每1 cm馬毛的檢測結果，在距毛囊16.48 mm處觀察到較強的目標藥物信號。由于馬毛平均每月以2.0 cm的速度生長，可判斷在采樣日期前25天給藥。

測試樣品為2017年7月13日采集的馬毛，該馬匹在2017年6月上旬，連續3天注射15至20 mL 0.1％的地塞米松磷酸鈉水溶液（Fujita Pharmaceutical Co）。iMScope TRIO的測量間隔在x方向上為80 μm，在y方向上為5 μm，激光斑點大小為2（系統參數）。

在該實驗中，測量總長為4cm的馬毛，將其劃分為1cm的區間分別進行檢測。在圖6（B）中，所得數據雖然分為4個部分，但馬毛樣本并未被分割：4cm長的馬毛被固定在ITO載玻片上。

從毛囊向*進行掃描，并在距毛囊約16.48 mm處，檢測到較高強度地塞米松磷酸酯信號。該結果是*從毛發中直接檢測到原本會于體內迅速代謝的磷酸酯，具有重要意義。此處質譜成像結果使用強度來表示峰強度，并在300-1500強度范圍內以多色帶顯示。在這一結果中暖色表示較高的峰強度。

6.討論

本實驗中，根據目標化合物離子化效果選擇負離子模式進行分析，成功在馬毛中檢測出目標藥物。給藥后的馬毛樣本中，在距毛囊16.48 mm位置處觀察到較強的藥物信號。馬毛的平均生長速度為每月2cm，是人類的兩倍。基于該生長速率以及大強度信號距離毛囊的位置估算給藥時間，大約在24-25天前。根據給藥記錄，該藥物在采集毛發前約一個月給藥，通過對比該信息，認為藥物定位正確。

另一方面，盡管離子強度較低，但是在毛囊附近依然檢測到一些信號。經確認質譜圖，發現該信號源自噪聲，由此認為進一步提高離子化效率和信噪比對分析實際樣品十分重要。為達到這一目標，可能需要進一步改進基質涂覆方法或選擇其他基質。

7.總結與展望

地塞米松磷酸鈉是一種經獲準使用的抗炎藥，但禁止在比賽前使用(13)。近一次在2016年12月東京大獎賽上，賽馬阿波羅肯塔基在賽后發現使用過這一藥物的事件依然記憶猶新。本次結果是將iMLayer基質升華與iMScope TRIO成像質譜分析相結合，應用于違禁藥物檢測領域的示例。

此外，由于磷酸酯可在體內迅速代謝，直接在毛發中檢測到未變化藥物同樣是一項十分重要的成果。另一方面，由于在成像結果中存在大量噪聲，有必要對毛發預處理流程進行進一步優化，提高離子強度。從該檢測結果來看，探索對可檢測藥物（包括合成類固醇類）定量分析方法的建立也是*的。盡管該應用仍存在許多問題以待解決，但我們依然認為iMScope TRIO的潛力十分值得期待。

8.馬毛分析的可能性

當前，世界范圍內關于賽馬違禁藥物控制的討論很多，討論賽馬違禁藥物檢測和賽馬傷害保護（ICRAV：賽馬分析專家和獸醫會議）的會議每兩年召開一次。2018年，在阿拉伯聯合酋長國的迪拜舉行該會議，作者*參加并介紹了這項研究結果。圖7顯示了會場和Meydan賽馬場的景色。能夠在世界賽馬場之一的Meydan賽馬場旁會議廳中展示這項研究，是迄今為止作者一生中難忘的事件之一。

通常，來自日本的參會者均為JRA相關人員或賽馬化學實驗室的研究人員，而作者則是大學中的參會者。不僅如此，來自香港賽馬會、澳大利亞賽馬會和其他地方的研究人員對使用IMS進行藥物檢測產生了濃厚興趣并寄予厚望，討論非?；钴S。

2018年11月，在撰寫本文時，巖手賽馬比賽中參賽的賽馬Ubatouban被檢測出使用禁用藥品去氫睪酮(14)。今后，作者將繼續改進和優化該檢測方法（包括簡化毛發前處理技術），使這種來自日本的新型檢測方法在世界賽馬領域中用以進行違禁藥品檢測。

作者同時還得到島津制作所的大力支持，并與Equine   Racing Co., Ltd.的全體員工進行廣泛合作，其中來自Equine   Racing Co., Ltd.的代表人也是本文的合著者。

作者將在圖8中展示馬毛采樣圖片以及作者和合著者的新照片作為本文的結尾。

圖7 ICRAV2018

（A）、（B）ICRAV 2018會場的場景，（C）舉行ICRAV的Meydan賽馬場傾城。Meydan賽馬場景色壯觀，其規模和完備程度在日本也*。

圖8參觀Equine Racing Co., Ltd.

（A）Equine Racing Co., Ltd.的工作人員介紹馬匹。（B）在馬腿上可以看到的稱為“栗子”的部分：角質化的退化拇指（C）鬃毛采樣 （D）作者（右）和合著者（左）的近期照片。

參考資料

(1)Masahiro Ohno (2005) Asahi Law Review, 32, 144-199

(2)Dai Mizuno (2017) Analysis, 12, 589-590

(3)Shima N et al. (2017) Drug. Metab. Dispos., 45, 286-293, https://doi.org/10.1124/dmd.116.074211

(4)Wong JKY et al. (2018) J. Pharm. Biomed. Anal., 158,   189-203, https://doi.org/10.1016/j.jpba.2018.05.043

(5)Madry MM et al. (2016) BMC Vet. Res., 12, 84, https://doi.org/10.1186/s12917-016-0709-5

(6)Kamata T et al. (2015) Anal. Chem., 87, 576-81,   https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.5b00971

(7)Hang W, Ying Wang (2017) Anal. Chimica Acta, 975,   42-51, https://doi.org/10.1016Zj.aca.2017.04.012

(8)Harada T et al. (2009)   Anal. Chem., 81,9153-7,   https://doi.org/10.1021/ac901872n

(9)https://www.shimadzu.co.jp/labcamp/

(10)Shimma S et al. (2013) J. Mass Spectrom., 48, 1285-90,   https://doi.org/10.1002/jms.328

(11)Nakamura J et al. (2017) Anal. Bioanal. Chem., 409, 1697-1706, https://10.1007/s00216-016-0118-4

(12)Shimma S et al.(2016) Anal. Bioanal. Chem., 408, 7607-7615,   https://doi.org/10.1007/s00216-016-9594-9

(13)http://company.jra.jp/0000/law/law07/07.pdf

(14) http://www.iwatekeiba.or.jp/news/180915i

本文中描述的產品尚未獲得日本《藥品和醫療設備法》批準，尚不能用作醫療設備。該設備不能用于醫學檢查、治療或相關程序。

iMScope TRIO和iMLayer是島津株式會社在日本和/或其他國家的商標。

在本文中，無論是否以商標符號“ TM”或“®”出現，第三方商標和商品名稱均指實體或其產品/服務。