產品采集與樣品處理

于同一批 號的 二個運輸包裝中至少抽取 12個蕞小銷售包裝樣品，1/4樣品用于檢測，1/4樣品用于留樣，另 1/2樣品（可就地封存）必要時用于復檢。抽樣的蕞小銷售包裝不應有破裂，檢驗前不得啟開。

在100級凈化條件下用無菌方法打開用于檢測的至少 3個包裝，從每個包裝中取樣，準確稱取10g±1g樣品。剪碎后加人到200ml滅菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個生理鹽水樣液。液體產品用原液直接做樣液。

如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導致不能吸出足夠樣液時，稀釋液量可按每次 50ml遞增，直至能吸出足夠測試用樣液。在計算細菌菌落總數與真菌菌落總數時相應調整稀釋度。

B2  細菌菌落總數與初始污染菌檢測方法

本方法適用于產品初始污染菌與細菌菌落總數（以下統稱為細菌菌落總數）檢測。

B2.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作菌落計數。共接種 5個平皿，每個平皿中加人 1ml樣液，然后用冷卻至45℃左右的熔化的營養瓊脂培養基 15～20ml倒人每個平皿內混合均勻 。待瓊脂凝固后翻轉平皿置 35℃±2℃培養 48h后，計算平板上的菌落數。

B2.2 結果報告

菌落呈片狀生長的平板不宜采用；計數符合要求的平板上的菌落，按式（B1）計算結果：

X1=A×（K÷5）

式中X1—–細菌菌落總數 cfu/g或cfu/mL；

A——5塊營養瓊脂培養基平板上的細菌菌落總數；

K——稀釋度。

當菌落數在 100以內，按實有數報告，大于 100時采用二位有效數字。

如果樣品菌落總數超過本標準的規定，按 B2.3進行復檢和結果報告。

B2.3 復檢方法

將留存的復檢樣品依前法復測 2次，2次結果平均值都達到本標準的規定，則判定被檢樣品合格；其中有任何 1次結果平均值超過本標準規定，則判定被檢樣品不合格。

B3  大腸菌群檢測方法

B3.1 操作步驟

取樣液 5ml接種 50ml，乳糖膽鹽發酵管，置 35℃±2℃培養 24h，如不產酸也不產氣，則報告為大腸菌群陰性。

如產酸產氣，則劃線接種伊紅美藍瓊脂平板，置35℃±2℃培養 18～24h，觀察平板上菌落形態。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤，也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色，中心較深的菌落。

取疑似菌落 1-2個作革蘭氏染色鏡檢，同時接種乳糖發醉管，置 35℃±2℃培養 24h，觀察產氣情況。

B3.2 結果報告

凡乳糖膽鹽發酵骨產酸產氣，乳糖發酵管產酸產氣，在伊紅美藍平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌，可報告被檢樣品檢出大腸桿菌。

B4  綠膿桿菌檢測方法

B4.1 操作步驟

取樣液 5ml，加人到50ml SCDLP培養液中，充分混勻，置 35℃±2℃培養 18～24h。如有綠膿桿菌生長，培養液農面呈現一層薄菌膜，培養液常呈黃綠色或藍綠色。從培養液的薄菌膜處挑取培養物，劃線接種十六烷*基溴化胺瓊脂平板，置 35℃±2℃ 培養 18～24h，觀察菌落特征。綠膿桿菌在此培養基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養基略帶粉紅色，其他菌不長。

取可疑菌落涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應進行下列試驗：

氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內，用無菌玻棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基對苯二胺試液，30s內出現粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗陽性，不變色者為陰性。

綠膿菌素試驗：取2-3個可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測定用培養基斜面，35℃±2℃培養24h，加入 3～5ml，充分振蕩使培養物中可能存在的綠膿菌素溶解，待三-氯-甲-烷呈藍色時，用吸管移到另一試管中并加人 1mol/L的鹽酸1mL，振蕩后靜置片刻。如上層出現粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。

硝酸鹽還原產氣試驗：挑取被檢菌落純培養物接種在硝酸鹽脈水培養基中，置 35C12C培養24h培養基小倒管中有氣者即為陽性

明膠液化試驗:取可疑菌落純培養物，穿刺接種在明膠培養基內，置 35℃±2℃培養 24h，取出放于4～10C，如仍呈液態為陽性，凝固者為陰性。

42℃生長試驗：取可疑培養物，接種在普通瓊脂斜面培養基上，置 42℃培養 24～48h，有綠膿桿菌生長為陽性。

B4.2 結果報告

被檢樣品經增菌分離培養后，證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿桿菌試驗均為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌 如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。

B5 金黃色葡萄球菌檢測方法

B5.1 操作步驟

取樣液 5ml，加入到 50mL SCDLP培養液中，充分混勻，置 35℃±2℃培養 24h，自上述增菌液中取1～2接種環，劃線接種在血瓊脂培養基上，置 35℃±2℃培養24～48h。在血瓊脂平板上該菌菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。

挑取典型菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄狀，無芽胞與莢膜。鏡檢符合 上述情況，應進行下列試驗：

甘露醇發酵試驗：取上述菌落接種甘露醇培養液，置 35℃±2℃培養 24h，發酵甘露醇產酸者為陽性。

血漿凝固酶試驗：（1）玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔血漿，挑:取菌落分別與生理鹽水和血漿混合，5min如血漿內出現團塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固則為陽性，如兩者均無凝固則為陰性。凡鹽水滴與血漿滴均有凝固現象，再進行試管凝固酶試驗；（2）試管法：吸取 1：4新鮮血漿 0.5ml，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌 24hrou湯培養物 0.55mL，混勻，放 35℃±2℃溫箱或水浴中，每半小時觀察一次，24h之內呈現凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株湯培養物各0.5ml，作為陽性與陰性對照。

B5.2 結果報告

凡在瓊脂平板上有可疑菌落生長，鏡檢為革蘭氏陽性葡萄球菌，并能發酵甘露醇產酸，血漿凝固酶試驗陽性者，可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。

B6 溶血性鏈球菌檢測方法

B6.1 操作步驟

取樣液 5ml加人到 50ml葡萄糖ROU湯， 35℃±2℃培養 24h，將培養物劃線接種血瓊脂平板， 35℃±2℃培養24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血平板上為灰自色，半透明或不透明，針尖狀突起，表面光滑，邊緣整齊，周圍有無色透明溶血圈。

挑取典型菌落作涂片革蘭氏染色鏡檢，應為革蘭氏陽性，呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況，應進行下列試驗：

鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿 0.2ml（0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻，經離心沉淀，吸取上清液），加人 0.8ml滅菌生理鹽水，混勻后再加人待檢菌 24h rou湯培養物0.5ml和0.25%氯化鈣0.25ml，混勻，放 35℃±2℃水浴中，2min觀察一次（一般10min內可凝固），待血漿凝固后繼續觀察并記錄溶化時間。如 2h內不溶化，繼續放置 24h觀察，如凝塊全部溶化為陽性，24h仍不溶化為陰性。

桿菌膚敏感試驗：將被檢菌菌液涂于血平板上，用滅菌鑷子取每片含 0.04單位桿菌膚的紙片放在平板表面仁，同時以已知陽性菌株作對照，在 35℃±2℃下放置 18～24h，有抑菌帶者為陽性。

B6.2 結果報告

鏡檢革蘭氏陽性鏈狀排列球菌，血平板上呈現溶血圈，鏈激酶和桿菌膚試驗陽性，可報告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌。

B7 真菌菌落總數檢測方法

B7.1 操作步驟

待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作真菌計數。共接種5個平皿，每個平皿中加人 1ml樣液，然后用冷卻至 45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養基 15 ～25mL倒人每個平皿內混合均勻，瓊脂凝固后翻轉平皿置 25℃±2℃培養 7天，分別于 3，5，7天觀察，計算平板上的菌落數，如果發現菌落蔓延，以前 一次的菌落計數為準。

B7.2 結果報告

菌落呈片狀生長的平板不宜采用；計數符合要求的平板上的菌落，按式（B2）計算結果：

X2=B×（K÷5）

式中X2—–真菌菌落總數，cfu/g或cfu/mL；

B—–5塊沙氏瓊脂培養基平板上的真菌菌落總數;

K—–稀釋度。

當菌落數在 100以內，按實有數報告，大于 100時采用二位有效數字。

如果樣品菌落總數超過本標準的規定，按 B7.3進行復檢和結果報告。

B7.3 復檢方法

將留存的復檢樣品依前法復測 2次，2次結果都達到本標準的規定，則判定被檢樣品合格；其中有任何 1次結果超過本標準規定，則判定被檢樣品不合格。

B8 真菌定性檢測方法

B8.1 操作步驟

取樣液 5mL加入到50mL沙氏培養基中， 25℃±2℃培養 7天，逐日觀察有無真菌生長。 

B8.2 結果報告

培養管混濁應轉種沙氏瓊脂培養基，證實有真菌生長，可報告被檢樣品檢出真菌。