維生素D是一種脂溶性維生素，其具有促進(jìn)生長和骨骼鈣化，促進(jìn)牙齒健全、用于治療佝僂病、骨軟化癥等功能作用，是一種大家廣為熟知的營養(yǎng)元素。《中國藥典》2020年版《0722維生素D測定法》，保留原先的第一、二、三法外，新增加了第四法——柱切換二維液相法。

本次，小編和您一起探討新加入的第四法。

 什么是柱切換二維液相法？

柱切換二維液相法是將不同選擇性分離柱組合，加強(qiáng)分離能力的聯(lián)用技術(shù)。柱切換液相色譜系統(tǒng)通常由第一維分離柱和第二維分離柱串聯(lián)組成，兩柱之間以切換閥作為接口，通過流動相流路的改變，將部分或全部第一維柱流出的組分，導(dǎo)入第二維柱進(jìn)行二次分離，從而起到凈化目標(biāo)化合物，提高系統(tǒng)分離能力的作用。如果只是將部分組分導(dǎo)入第二維柱分析，通常又稱為中心切割二維液相法，用LC+LC表示；如果是全部組分全部導(dǎo)入第二維柱，通常稱為全二維液相色譜法，用LC×LC表示。

 新增加的第四法，優(yōu)點(diǎn)有哪些？

《中國藥典》2020年版四部《0722維生素D測定法》，采用高效液相色譜法測定維生素D制劑中所含維生素D含量，以及維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D（折算成維生素D）的總量。

•當(dāng)待測藥品中無維生素A及其他雜質(zhì)干擾可用第一法測定，否則應(yīng)按第二法處理后測定；

•如果按第二法處理后，前維生素D峰仍受雜質(zhì)干擾，僅有維生素D峰可以分離時(shí)，則應(yīng)按第三法測定，或不經(jīng)前處理按第四法測定。第二法和第三法的供試液制備需要采用“正相收集、反相洗脫”，第三法為了進(jìn)一步去除前維生素D峰的雜質(zhì)干擾，還增加了水浴加熱再凈化的過程，前處理較為麻煩，一個(gè)實(shí)驗(yàn)常常需要2~3天時(shí)間來完成；

•第四法通過在線凈化的方式，省去了復(fù)雜的前處理步驟，讓儀器來代替復(fù)雜的人工操作！且相比較而言，第四法的儀器配置更為簡單，是藥品中維生素D檢測的不錯(cuò)選擇！

 島津應(yīng)對方案

該方案在島津中心切割二維液相系統(tǒng)上進(jìn)行。系統(tǒng)配置包括一維二元高壓系統(tǒng)和二維四元低壓系統(tǒng)，兩個(gè)紫外檢測器，一個(gè)進(jìn)樣單元和一個(gè)柱溫箱；柱溫箱中裝載兩根不同性能的色譜柱，并通過加載一個(gè)高壓流路切換閥實(shí)現(xiàn)一維和二維的實(shí)時(shí)切換。

圖1. 島津二維液相（中心切割）系統(tǒng)

 01 前處理：

按照《中國藥典》2020年版四部通則0722維生素D測定法第四法要求進(jìn)行制備。

 02 分析條件：

第一維色譜柱：HILIC-10（2.1x150 mm，3 µm）

第二維色譜柱：RX-SIL（3.0x100 mm，1.8 µm）

第一維流動相：A相：正己烷；

B相：正己烷-正戊烷-異丙醇（98：1：1）；

按下表程序進(jìn)行梯度洗脫

第二維流動相：正己烷-正戊醇-異丙醇（996：2：2），等度洗脫

流速：0.5 mL/min                

進(jìn)樣體積：100 µL

柱溫：40℃                             

檢測波長：265 nm

收集管：聚醚醚酮（peek）管，內(nèi)徑0.0762 cm（0.03英寸），20 m，容積約9 mL

 03 對照品溶液色譜圖：

取方法中的校正因子f2上機(jī)測試，得到對照品溶液色譜圖。其中第一維液相維生素D的理論塔板數(shù)超過2500，與前維生素D的分離度＞5；各峰的重復(fù)性為0.76%~1.46%（n=5），均滿足藥典的要求。

圖2. 對照品溶液第一維色譜圖（上）和第二維色譜圖（下）

 04 供試品溶液色譜圖：

取制備好的供試品溶液上機(jī)分析。在第一維色譜圖中，由于維生素A醇和油脂的干擾，前維生素D被大量雜質(zhì)峰包裹，無法檢測；將該時(shí)間段的物質(zhì)切入第二維色譜中繼續(xù)分析，前維生素D和維A醇、油脂等雜質(zhì)在第二維色譜圖中得到了有效的分離。

圖3. 供試品溶液第一維色譜圖（上）和第二維色譜圖（下）

 05 參與驗(yàn)標(biāo)工作：

島津廣州分析中心參與了該方法的驗(yàn)標(biāo)工作；制標(biāo)專家和島津工程師共同建立并驗(yàn)證了方法，方法可靠、穩(wěn)定，可有效地應(yīng)對《中國藥典》0722通則第四法柱切換色譜法。