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樣本標(biāo)記/追蹤與質(zhì)控在大規(guī)模新一代測序 項目中的必要性與技術(shù)方案
必要性：
隨著醫(yī)學(xué)項目在*范圍內(nèi)的不斷開展，基于新一代測序（NGS）技術(shù)的大規(guī)?；蚪M數(shù)據(jù)采集已經(jīng)成為重要的研究手段之一。在此基礎(chǔ)上建立起來的大數(shù)據(jù)平臺，輔以、全面的健康和醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)，將為疾病的診斷與治療，藥物的研發(fā)與個體用藥，人群的健康保障等臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究帶來極大的推動。
在大規(guī)模人群中開展NGS測序工作時，樣本的準(zhǔn)確性、可溯源性將會對zui終的大數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生不可忽視的影響。由于NGS測序流程的復(fù)雜性（參見下圖，NGS測序工作經(jīng)典流程），在樣本庫內(nèi)得到準(zhǔn)確標(biāo)記的樣本，在測序流程中仍然有一定幾率會發(fā)生混淆或者污染。根據(jù)上大型測序中心的估算，隨著測序樣本量的增加，一個操作流程完善、工作人員受過專業(yè)培訓(xùn)的基因檢測實驗室，仍然有可能產(chǎn)生千分之一左右的樣本偏差。
因此，一種準(zhǔn)確有效卻又成本低廉的樣本標(biāo)記與追蹤手段，在大規(guī)模NGS測序工作中具有重要的現(xiàn)實意義。在美國ACMG（美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)院）發(fā)布的“臨床實驗室NGS測序標(biāo)準(zhǔn)”中指明：“相關(guān)實驗室必須采取措施，避免樣本混淆，并能夠隨時追蹤與確認(rèn)zui終結(jié)果”。2017年3月，中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會發(fā)布的“臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識”中進(jìn)一步闡明：“為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNV位點(diǎn)或其他標(biāo)簽作為樣本身份標(biāo)識（sample ID），在檢測前對每個樣本進(jìn)行SNV位點(diǎn)信息的測定，在NGS檢測后對上述位點(diǎn)進(jìn)行追蹤，證明沒有交叉污染”。
同時，一個大型測序數(shù)據(jù)庫中面臨的樣本種類較為繁雜，其中與腫瘤相關(guān)的樣本類型如石蠟包埋切片（FFPE）中提取的DNA、血漿中提取的循環(huán)腫瘤DNA等，均在正確標(biāo)記、追蹤之外，還需在NGS文庫制備之前，對其中DNA片段降解程度進(jìn)行有效評估，從而防止質(zhì)量較差的樣本帶來的測序成本損失。
技術(shù)方案：
樣本標(biāo)記與跟蹤目前的主要方案，是從待測序列（全基因組、全外顯子組、靶向片段等）中選擇若干標(biāo)志性單堿基核苷酸變異（SNV），在樣本入庫及測序前，進(jìn)行基于這些位點(diǎn)的等位基因分型，從而確保樣本的收集與使用流程中沒有發(fā)生混淆。在測序完成后，再次利用之前這些位點(diǎn)的基因數(shù)據(jù)，與測序結(jié)果進(jìn)行再次驗證比對，如果信息一致，即可確認(rèn)樣本正確性，以及測序覆蓋范圍與數(shù)據(jù)質(zhì)量均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。
為達(dá)到足夠的區(qū)分效果，SNV需要滿足以下兩點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)：1）在待檢測人群（中國人群）中具有較高的雜合度與區(qū)分力；2）需達(dá)到一定數(shù)量（30-40個）以在大規(guī)模樣本庫中仍可區(qū)分所有個體樣本。根據(jù)這兩點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外*人類基因組測序中心Broad Institute與華大基因均采用了美國Agena Bioscience公司基于核酸質(zhì)譜MassARRAY®開發(fā)的樣本標(biāo)記/追蹤技術(shù)。
該技術(shù)是利用MassARRAY®可以在一個反應(yīng)中完成40多重SNV分型的特點(diǎn)，根據(jù)不同測序項目目標(biāo)片段，選擇約40個SNV位點(diǎn)（包括性染色體標(biāo)記位點(diǎn)，用于追蹤樣本性別信息），并加入用于樣本降解程度評估的片段完整性內(nèi)參標(biāo)記，在同一次反應(yīng)中，同時完成對樣本的標(biāo)記與質(zhì)控，隨后以報告軟件自動生成檢測結(jié)果，并整合進(jìn)入樣本庫相關(guān)數(shù)據(jù)。
根據(jù)樣本庫與數(shù)據(jù)庫規(guī)模，MassARRAY®平臺可采用384格式。在一天內(nèi)，該平臺可完成對6張384孔芯片（即2304個樣本）的標(biāo)記/追蹤與質(zhì)控。
利用MassARRAY®強(qiáng)大的定制功能，對不同的測序項目可以選取不同的SNV位點(diǎn)，整合為新的檢測組合，因此具有更高的靈活性與針對性。
隨著醫(yī)學(xué)項目在*范圍內(nèi)的不斷開展，基于新一代測序（NGS）技術(shù)的大規(guī)?；蚪M數(shù)據(jù)采集已經(jīng)成為重要的研究手段之一。在此基礎(chǔ)上建立起來的大數(shù)據(jù)平臺，輔以、全面的健康和醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)，將為疾病的診斷與治療，藥物的研發(fā)與個體用藥，人群的健康保障等臨床與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究帶來極大的推動。
在大規(guī)模人群中開展NGS測序工作時，樣本的準(zhǔn)確性、可溯源性將會對zui終的大數(shù)據(jù)質(zhì)量產(chǎn)生不可忽視的影響。由于NGS測序流程的復(fù)雜性（參見下圖，NGS測序工作經(jīng)典流程），在樣本庫內(nèi)得到準(zhǔn)確標(biāo)記的樣本，在測序流程中仍然有一定幾率會發(fā)生混淆或者污染。根據(jù)上大型測序中心的估算，隨著測序樣本量的增加，一個操作流程完善、工作人員受過專業(yè)培訓(xùn)的基因檢測實驗室，仍然有可能產(chǎn)生千分之一左右的樣本偏差。
因此，一種準(zhǔn)確有效卻又成本低廉的樣本標(biāo)記與追蹤手段，在大規(guī)模NGS測序工作中具有重要的現(xiàn)實意義。在美國ACMG（美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)院）發(fā)布的“臨床實驗室NGS測序標(biāo)準(zhǔn)”中指明：“相關(guān)實驗室必須采取措施，避免樣本混淆，并能夠隨時追蹤與確認(rèn)zui終結(jié)果”。2017年3月，中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會發(fā)布的“臨床分子病理實驗室二代基因測序檢測專家共識”中進(jìn)一步闡明：“為確保檢測過程中樣本沒有混淆或污染，可選用多個SNV位點(diǎn)或其他標(biāo)簽作為樣本身份標(biāo)識（sample ID），在檢測前對每個樣本進(jìn)行SNV位點(diǎn)信息的測定，在NGS檢測后對上述位點(diǎn)進(jìn)行追蹤，證明沒有交叉污染”。
同時，一個大型測序數(shù)據(jù)庫中面臨的樣本種類較為繁雜，其中與腫瘤相關(guān)的樣本類型如石蠟包埋切片（FFPE）中提取的DNA、血漿中提取的循環(huán)腫瘤DNA等，均在正確標(biāo)記、追蹤之外，還需在NGS文庫制備之前，對其中DNA片段降解程度進(jìn)行有效評估，從而防止質(zhì)量較差的樣本帶來的測序成本損失。
技術(shù)方案：
樣本標(biāo)記與跟蹤目前的主要方案，是從待測序列（全基因組、全外顯子組、靶向片段等）中選擇若干標(biāo)志性單堿基核苷酸變異（SNV），在樣本入庫及測序前，進(jìn)行基于這些位點(diǎn)的等位基因分型，從而確保樣本的收集與使用流程中沒有發(fā)生混淆。在測序完成后，再次利用之前這些位點(diǎn)的基因數(shù)據(jù)，與測序結(jié)果進(jìn)行再次驗證比對，如果信息一致，即可確認(rèn)樣本正確性，以及測序覆蓋范圍與數(shù)據(jù)質(zhì)量均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。
為達(dá)到足夠的區(qū)分效果，SNV需要滿足以下兩點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)：1）在待檢測人群（中國人群）中具有較高的雜合度與區(qū)分力；2）需達(dá)到一定數(shù)量（30-40個）以在大規(guī)模樣本庫中仍可區(qū)分所有個體樣本。根據(jù)這兩點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外*人類基因組測序中心Broad Institute與華大基因均采用了美國Agena Bioscience公司基于核酸質(zhì)譜MassARRAY®開發(fā)的樣本標(biāo)記/追蹤技術(shù)。
該技術(shù)是利用MassARRAY®可以在一個反應(yīng)中完成40多重SNV分型的特點(diǎn)，根據(jù)不同測序項目目標(biāo)片段，選擇約40個SNV位點(diǎn)（包括性染色體標(biāo)記位點(diǎn)，用于追蹤樣本性別信息），并加入用于樣本降解程度評估的片段完整性內(nèi)參標(biāo)記，在同一次反應(yīng)中，同時完成對樣本的標(biāo)記與質(zhì)控，隨后以報告軟件自動生成檢測結(jié)果，并整合進(jìn)入樣本庫相關(guān)數(shù)據(jù)。
根據(jù)樣本庫與數(shù)據(jù)庫規(guī)模，MassARRAY®平臺可采用384格式。在一天內(nèi)，該平臺可完成對6張384孔芯片（即2304個樣本）的標(biāo)記/追蹤與質(zhì)控。
利用MassARRAY®強(qiáng)大的定制功能，對不同的測序項目可以選取不同的SNV位點(diǎn)，整合為新的檢測組合，因此具有更高的靈活性與針對性。
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