您好, 歡迎來到化工儀器網
細菌多點接種儀在臨床抗菌藥物的研究應用
《第六屆全國抗菌藥物臨床藥理學術會議論文集》2006
臨床分離耐甲氧西林金黃色葡萄球菌SCCmec基因分型研究
【摘要】：目的金葡萄球菌對甲氧西林耐藥是由mecA基因介導的,這種基因是由一種*的可移動的基因元件所攜帶,稱為葡萄球菌染色體盒Staphylococcal chromosomal cassette(SCCmec),整合在MRSA菌株的染色體上。目前國外采用分子生物學技術對SCCmee基因分類已經分成Ⅰ-Ⅴ 5種不同的類型,在各個分型中又分別有具體的亞型,各型發生的頻率不同。SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ主要存在于院內感染MRSA,攜帶有多重耐藥基因, SCCmec Ⅳ型和Ⅴ型的大小要比SCCmec Ⅰ-Ⅲ小得多,主要在社區感染的MRSA。本研究目的是通過對我國多所醫院分離到的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的研究,建立MRSA SCCmec分類方法;了解國內MRSA菌株流行類別,確定我國臨床分離到的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)葡萄球菌染色體盒(SCCmec)基因型,為臨床防治疾病的流行與控制感染提供依據。方法金黃色葡萄球菌來源于2005年1月至2005年12月全國17家醫院分離菌株,共計266株,其中160株為甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌。送檢病房主要包括呼吸、血液、感染、普通外科、神經外科、ICU等病房,標本部位包括痰、血、引流液、關節液、膿液、尿液、傷口分泌物等。標準SCCmec分型的陽性對照菌株來源美國Rockefeller University,Hdeminia de Lencastre 教授贈送的6株標準菌株:COL(SCCmec Type Ⅰ)、HPV107(SCCmec Type ⅠA)、BK2464(SCCmec Type Ⅱ)、 ANS46(SCCmec Type Ⅲ)、HU25(SCCmec Type ⅢA)、BM18(SCCmec Type Ⅳ),質控菌株ATCC29213。抗菌藥物標準品包括:苯唑西林、甲氧西林、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢吡肟、亞胺培南、紅霉素、四環素、米諾環素、克林霉素、慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星、環丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星、莫西沙星、利福平、SMZco、萬古霉素、替考拉寧。MIC測定:采用標準平皿二倍稀釋法。將金黃色葡萄球菌接種在MH肉湯培養基,35℃孵育16-20h。被試菌懸液用細菌多點接種儀（SAKUMA）接種,每點接種量為 104CFU。抗菌藥物測定濃度范圍256-0．016 mg／L。根據2002年Oliveira DC實驗方法合成9對隨機引物,擴增的產物長度與目的基因為495bp(pls), 284bp(kdp),209bp(mecI),342bp(dcs),243bp(pI258,Tn554), 3414bp(Tn554,orfX),81bp(IS431,pUB110),303bp(IS431,pT181),160bp(mecA);PCR擴增反應體系:40μL 反應體系內含20μL 2×Taq PCR MasterMix,MgCL2,模板DNA,根據文獻加入不同量的引物(濃度 400-1000nM),補水至總反應體積40μL。反應條件:94℃預變性4min;然后94℃變性30s,53℃退火30s, 72℃延伸1min,30個循環;再72℃后延伸4min;瓊脂糖濃度2％,每孔加樣量為2μL PCR擴增產物,0．5×Tris- 硼酸-EDTA緩沖液電泳(電壓80V),0．5ug/ml溴化乙啶染色,在紫外線下觀察產物片段。結果 266株金黃色葡萄球菌對多種抗生素呈現不同程度的耐藥。苯唑西林的MIC值范圍是0．125-256mg／L,耐藥率63．9％, 甲氧西林的MIC值范圍是0．25-256mg／L,耐藥率62．0％,頭孢西丁的MIC值范圍是2-256 mg/L,耐藥率 62．8％,其它抗生素耐藥率在42．5％-84．2％,但米諾環素耐藥率為7．5％, SMZ/TMP的耐藥率為21．1％。所有菌株對萬古霉素和替考拉寧敏感,未發現對萬古霉素中間耐藥的菌株。266株金黃色葡萄球菌中,MRSA 菌株為160株,占臨床分離菌株的60．2％。MRSA菌株對抗菌藥物耐藥性明顯高于其他藥物,對米諾環素耐藥率為14．4％,SMZ／TMP耐藥率為32．5％。160株MRSA PCR方法分型SCCmecⅡ型1株(0．6％),SCCmecⅡ型的亞型4株(2．5％),SCCmecⅢ型20株(12．5％):主要類型為SCCmec Ⅲ型的含有342bp(dcs)擴增條帶的菌株,占MRSA菌株67．5％,該類型與SCCmecⅢ型比較不含有303bp擴增條帶,比SCCmec ⅢA型又增加了342bp(dcs)擴增條帶,從目前結果分析可能屬于SCCmec Ⅲ型的新型變異株,也可能是SCCmec ⅢA型的新型變異株,有待進一步研究;SCCmec ⅢA型11株(6．9％),16株細菌未能分型(10％),未發現Ⅰ型和Ⅳ型。主要分離到的SCCmecⅢ型主要包括的三個類型:含有dcs基因SCCmecⅢ型,*與文獻相符SCCmecⅢ型,以及SCCmecⅢA型,共計139株細菌對23種抗菌藥物耐藥情況為:對青霉素類以及頭孢菌素類、紅霉素、克林霉素、四環素均耐藥,對亞胺培南耐藥率相似。氨基糖苷類SCCmecⅢA型對阿米卡星的耐藥率為 54．5％,明顯低于另兩型,SCCmecⅢ-dcs型的對妥布霉素的耐藥率也低于SCCmecⅢ型與SCCmecⅢA,米諾環素的耐藥率均較低,三型分別為10．2％、10％、27．3％;喹諾酮類環丙沙星、左氧沙星三型耐藥結果相似, 加替沙星、莫西沙星對SCCmecⅢ-dcs型的耐藥率明顯高于另外兩型。利福平主要耐藥類型為SCCmecⅢ-dcs 型,SMZ／TMP主要耐藥類型為SCCmecⅢ型。結論我國臨床分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌以SCCmecⅢ型為主,該類型為多重耐藥菌株,基因組成與SCCmecⅢ型及ⅢA型有差異。
【作者單位】：北京大學臨床藥理研究所 北京大學臨床藥理研究所 北京大學臨床藥理研究所 北京大學臨床藥理研究所 北京大學臨床藥理研究所 北京大學臨床藥理研究所 北京大學臨床藥理研究所
【分類號】：R450