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杭州實了個驗生物科技有限公司
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熒光定量PCR（qPCR）是一種廣泛應用于基因表達分析、病原體檢測和基因分型的技術。羅氏LightCycler® 480是一款常用的熒光定量PCR儀，具有高靈敏度和穩定性。以下為詳細操作步驟，供參考使用。
一、實驗前準備
儀器檢查
確認LightCycler® 480主機、電腦及軟件處于正常工作狀態。
檢查加熱蓋是否清潔，避免污染或殘留物影響實驗結果。
確保電源連接穩定，避免實驗過程中斷電。
耗材與試劑準備
DNA模板或cDNA
引物和探針（如TaqMan探針或SYBR Green染料）
聚合酶（如Taq DNA聚合酶）
dNTPs
緩沖液
使用兼容的PCR反應板或毛細管（如96孔板或384孔板）。
準備熒光定量PCR試劑，包括：
若使用探針法，需確認探針與儀器檢測通道匹配（如FAM、HEX等）。
環境準備
實驗區域需清潔，避免氣溶膠污染。
建議在超凈臺或通風櫥中配制反應體系，減少外源DNA污染風險。
二、反應體系配制
計算反應體積
根據樣本數量和實驗設計，計算所需試劑總量（通常單反應體積為10-20 μL）。
預留額外10%體積以補償移液誤差。
配制主混合液（Master Mix）
將除模板外的所有試劑（緩沖液、dNTPs、引物、探針、聚合酶等）混合，渦旋振蕩后短暫離心。
分裝至PCR板或毛細管中，避免產生氣泡。
加入模板
在單獨區域加入DNA或cDNA模板，避免交叉污染。
每孔模板體積需保持一致（如2-5 μL）。
設置陰性對照（無模板對照，NTC）和陽性對照。
密封反應板
使用光學密封膜覆蓋反應板，確保密封性。
若使用毛細管，需檢查是否閉合。
三、程序設置與運行
啟動軟件
打開LightCycler® 480軟件，選擇“New Experiment"創建新實驗。
設置實驗名稱、保存路徑及用戶信息。
編輯程序
95℃ 10秒 → 65℃ 60秒 → 95℃連續升溫（0.1℃/秒）并采集熒光。
變性：95℃ 10-30秒
退火：50-60℃ 10-30秒（根據引物Tm值調整）
延伸：72℃ 10-30秒（視產物長度而定）
預變性階段：95℃維持3-10分鐘，激活聚合酶。
擴增循環（通常35-45個循環）：
熒光采集：在退火或延伸階段采集信號（根據染料類型選擇單色或多色檢測）。
熔解曲線分析（僅SYBR Green法）：
板布局設置
在軟件中定義樣本位置，標注對照孔和待測樣本孔。
選擇熒光通道（如FAM對應通道1，HEX對應通道2）。
運行程序
將反應板放入儀器，確認放置平穩。
點擊“Start"開始運行，實時監測擴增曲線。
四、數據分析
基線調整
軟件自動或手動設置基線范圍（通常為前3-15個循環）。
確保擴增曲線在閾值線（Threshold）附近呈現清晰的指數增長。
閾值設定
手動調整閾值線至指數增長期上方，軟件自動計算Ct值（循環閾值）。
結果解讀
定量分析：通過標準曲線計算模板濃度（絕對定量）或比較ΔΔCt值（相對定量）。
熔解曲線：SYBR Green法需檢查單峰（特異性擴增）或多峰（引物二聚體或污染）。
排除異常值（如NTC出現擴增提示污染）。
導出數據
保存實驗文件，導出Ct值、熔解曲線等數據。
生成報告（PDF或Excel格式）。
五、實驗后處理
儀器維護
關閉軟件和主機電源，清潔反應槽及加熱蓋。
定期進行校準（如光學校準或溫度校準）。
耗材處理
廢棄反應板按生物危害廢物處理。
毛細管需妥善丟棄，避免劃傷。
數據備份
將實驗結果備份至云端或外部存儲設備。
六、常見問題與解決方案
無擴增信號
檢查試劑活性（如聚合酶是否失活）。
確認引物探針設計正確，模板質量合格。
非特異性擴增
優化退火溫度或更換引物。
增加模板稀釋度減少抑制物影響。
重復性差
檢查移液精度，確保反應體系均一。
避免模板降解或污染。
注意事項
分區操作：模板添加與主混合液配制需在不同區域進行。
避免頻繁打開反應板，防止氣溶膠污染。
定期驗證儀器性能，確保數據可靠性。
以上為羅氏LightCycler® 480熒光定量PCR的標準操作流程，具體參數需根據實驗目的優化。
