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送給生物實驗室達人的10個“偷懶”技巧
閱讀：396 發布時間：2015-4-141 質粒DNA提取
提取質粒的時候，zui后一步的酒精揮發很關鍵，基本上是其后續的酶切反應的決定性因素。所以這一步盡量揮發長一點時間，是空調吹熱風，或是37度溫箱放長一點的時間，我試過室溫經過一夜，酶切很好。
將amp濃度提高到200ug/ml，下班前接種，次日一早收獲菌體，此時OD雖然不高，質粒豐度卻不一般。菌體量少些，操作體積（管數）也小（少）。
手提質粒，如果用氛氯仿和氯仿兩步抽提，再注意一下手法，嚴格按照參考書上面的操作的話，提出的質粒不比任何質粒提取試劑盒差，我感覺好像還好一點，我就用過一次試劑盒，比較了之后不如我手提的好，以后再也沒用過了。
2 Western Blot
做western blot的時候，大家往往會摸索一抗、二抗的濃度，封閉時間，曝光時間等等，而每次變換其中的一個條件就需要從新跑膠、轉膜，甚至重新提蛋白，這樣會浪費大量的時間。其實*沒有必要這樣。一次轉膜后，將PVDF膜晾干，裁減成小塊，保存起來，用的時候取出一塊，沒有任何影響。這對于摸索條件的戰友來說，節約了大量的時間。
做western blot 轉膜時，膠放在轉膜緩沖液中一段時間，待膠在含有甲醇的緩沖夜中縮小的差不多后裝好轉膜裝置，我的經驗是把膜印在膠上直接在膜上畫出預染maker條帶，方便的很。因為很多時候跑電泳時膠上的預染maker很清楚，等轉膜后就不是分辨的很清楚了。不過要注意畫好預染maker后就不要使膠和膜發生對位移動了，以防maker失去參照價值。
器具的清潔非常重要，開始做前，為了安全，尤其是裝膠的厚薄玻璃板，可以先用中性洗滌劑和自來水反復沖洗，確保無洗滌殘液后用蒸餾水沖洗2－3遍，然后用去離子水沖洗一遍。zui后用95％酒精再擦一遍后晾干備用。
配膠現用現配，先配下層膠（分離膠），后配上層膠（濃縮膠或積層膠），而且在臨灌膠前加APS并迅速混勻，即用移液槍抽吸與注入1－2次即可。
3 緩沖液和培養基配置
（1）將緩沖液配方中的成分分別以10-100倍配成母液儲存，需要的時候只需將相應的母液混合，補加水稀釋即可；
（2）配培養基時通常會忘記各成分的量，如配LB時的三個成分不記得到底哪個是5g，哪個要10個，因此可以在常用的試劑瓶的標簽上注明所需的量，如配LB時，在NaCl瓶外注明10 g/L，yeast 5 g/L，tryton 10 g/L等，很方便，不需要每次配之前臨時翻書。
4 PCR
在做克隆鑒定的時候經常需要在酶切鑒定前進行PCR鑒定，每次配置PCR反應液很繁瑣，可以將其配置類似kit的形式，按你需要的反應體系列表，然后放大100倍配置100×主反應液（100次反應），其中含buffer，Mg2＋，dNTPs，但不含引物和Taq酶，然后可以10×分裝或一管儲存在－20度，在需要的時候拿出融開，然后按所需的PCR反應個數吸取相應的倍數，再補加相應反應倍數的Taq和引物，混勻后分裝，這樣做的好處如下：
（1）可極大的節省寶貴的時間，可早點收工，看球；
（2）避免每次反應加樣不均的可能；
（3）大大減少PCR假陽性的產生。
5 酶切
如果是要做酶切，提質粒的zui后一步是用水溶解DNA，因為TE里面的離子會影響酶切的效率。
雙酶切制備克隆插入片段的載體，選擇帶有外源片段的質粒，是否酶切*，從電泳條帶的分子量上可以比較明確地判斷。空質粒單切*和雙切*在分子量上差異不大。
在做酶切時，也可以象PCR一樣配置主反應液，每次反應前先列好反應的體系，算好需要的反應數，然后按所需反應的體系按所需反應數放大，加入buffer、酶、水，質粒欄空缺，然后混合后按除質粒DNA的體積分裝，然后再在每管中加入相應體積的質粒DNA酶切，這樣做的好處如下，特別是當同時有10幾個陽性克隆需要鑒定時尤為明顯：
（1）各反應成分均一；
（2）可大大減少限制型內切酶的使用；
（3）節省時間。
6 大腸桿菌轉化實驗
有時候*天涂的轉化平板、次日早晨轉化子可能長成的菌落比較大（1~2毫米以上，BL21就長得快），下一步轉化子做質粒鑒定。這個情況下可以直接挑取一塊菌苔（勿帶出培養基），50微升酚/氯仿懸浮菌體，放置兩分鐘，加40微升TE抽提，上層TE吸出后再氯仿抽提一次，吸取上層TE即是質粒提取液。提取的質粒可以直接用于電泳和酶切。這樣操作，可以省去轉接液體試管的培養步驟，至少節省6~8小時的時間。但是，要在各步驟都控制得很好的情況下才能保證提取和酶切的效果，不同的實驗室或者操作者未必能夠很方便地重復。
轉化時一定要做一個宿主菌的對照，即重組質粒涂板后再用宿主菌涂響應抗性的平板，以確定第二天長出來的克隆是否正確，我當時做了三次轉化之后才發現不成功竟然是由于BL21可以在Amp（+）的平板上面生長。
7 蛋白質的表達、分離、純化
當蛋白大量的表達時，包含體的形成幾乎是不可避免的，而且很難通過改變一些誘導條件來改變，zui有效的辦法就是換表達系統，所以如果時間還充分的話，可以嘗試一下，如果時間較短了，還是安心的座包含體蛋白的處理算了，而且變性之后的蛋白通過一些方法復性率也可以達到60％以上。
8 PCR擴增產物的克隆
引物設計主要是要注意以下幾個事項：
（1）發夾結構；
（2）反向配對；
（3）GC含量（40－60%）；
（4）退火溫度（45－65度）；
（5）引物長度（18－27bp）；
（6）3' 端是C、G（提高結合度）；
（7）引物在序列中的錯配位點。
大致就這幾個方面，重要性依次降低，由其是3' 端不能形成發夾結構。
那么你說你這段能不能設計引物呢？其實設計引物都只是好中選優的問題。
9 細胞凍存和復蘇實驗
（1）可以提前把需要的體積的培養液放到培養瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里半小時到1小時，這樣溫度和ph值都已經細胞生長了。
（2）為防止凍存管在升溫時爆裂等，可以在放入水浴前就實現在超凈臺里把蓋子擰松一下然后再擰上。從液氮罐里拿出來不是說一定要分秒必爭地放入水浴。細胞從液氮的零下1百多度升到比如負八十這個過程對細胞沒有損害。有足夠的時間handle這些。只不過一旦細胞化了，就應該爭分奪秒地把它放入培養液了，主要是為了稀釋DMSO。常溫下高濃度DMSO對細胞的損害比較大。
（3）水浴溫度40℃應該也沒問題，但正規的protocol上從來都只說37℃。反正應該相差不大，但不能太高了。另外，不必等細胞全化了再從水浴里取出來。只要冰塊浮起來了就差不多了。我一般zui多水浴不超過1.5分鐘。然后經過噴酒精消毒什么的差不多又半分鐘過去了。每次都還有沒化的。先把已經融解的部分吸到培養瓶里，再從培養瓶里吸些培養液到凍存管里，余下的冰塊瞬間就化了，再一起吸到培養瓶里。
10 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）
（1）RT-PCR有兩種做法
條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但后來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利于PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。
（2）RT-PCR應具備的條件
高質量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（產物短點）；若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果由內標分子更好，但我發現其實很不容易將RNA的濃度以及內標分子的表達量調整的*一樣）；體系的均一性等。
（3）RACE
我做過RACE（3’RACE是寶生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但現在再進行另一個同源基因的3‘RACE時卻怎么也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因的3’UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3‘UTR太長的緣故。
（來源：丁香園）
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