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貨號：M5124
儲存條件：-20℃
產品組成
組分規格 | 規格 |
M-MLVGIII Reverse Transcriptase(200U/ul) | 50ul |
5×M-MLV First Strand Buffer | 500ul |
0.1M DTT | 100ul |
產品簡介
M-MLV GIII Reverse Transcriptase是通過基因修飾和重組技術獲得的第三代M-MLV逆轉錄酶。該酶相對于野生型M-MLV逆轉錄酶去除了RNase H活性，并大幅提高了熱穩定性（the best 反應溫度為50℃），從而大大提高了合成first鏈cDNA時的特異性和長度（最長可達12 kb），增強了對RNA復雜二級結構的耐受性。
酶活單位定義
37℃條件下，以Poly(A)-Oligo(dT)為模板/引物，在10 min內， 摻入1 nmol的[3H] dTTP所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。
質量控制
宿主原性DNA檢測
無宿主DNA污染
核酸內切酶殘留檢測
將酶液與超螺旋質粒DNA在37℃溫育4h，通過DNA電泳檢測質粒無變化。
核酸外切酶殘留檢測
將酶液與雙鏈DNA底物在37℃溫育16h，通過DNA電泳檢測雙鏈DNA底物無變化。
使用方法
質粒載體線性化與去磷酸化同步反應流程
1. 于冰上配制如下反應體系：
試劑 | 使用量 |
引物 | X ul |
Oligo(dT)20 | 終濃度2.5uM |
或隨機引物 | 終濃度2.5ng/ul |
或基因特異性引物 | 終濃度0.25uM |
模板 RNAa | 50 ng~1ug/20ul |
5× M-MLV First Strand Buffer | 4ul |
0.1 M DTT | 1ul |
M-MLV GIII Reverse Transcriptase (200 U/ul) | 1ul |
dNTP Mix (10 mM Each) | 1ul |
（可選）RNase Inhibitor (40 U/ul) | 1ul |
Nuclease-Free Water | To 20ul |
2. 輕柔吸打混勻后，瞬離；a. 推薦使用試劑盒提取的已去除基因組DNA污染的高質量RNA作為模板。
3. 若使用Oligo(dT)20或基因特異性引物，50℃溫育30 min；若使用隨機引物，先25℃溫育5 min，之后50℃溫育30 min；
注：若目的cDNA小于3 kb，溫育時間可縮短為15 min。
4. 反應結束后，85℃溫育5 min 以終止反應；
5. 將獲得的 cDNA 溶液置于冰上，用于后續實驗。
注：cDNA 溶液置于 -20℃可保存半年；置于 -80℃可長期儲存
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