T、B淋巴細胞分離

時間：2022/3/11閱讀：1501

原理

淋巴細胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡稱AET）處理的綿羊紅細胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細胞均能吸附AET-SRBC，形成牢固穩定而巨大的E-花環，較正常未處理的SRBC形成的E-花環百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復性好。再經淋巴細胞分層液分離時，AET-E花環易沉于管底，而未形成E-花環的T淋巴細胞，用低滲液解花環周圍的 AET-SRBC，便可獲得純T淋巴細胞，而B淋巴細胞可直接取自分層液的界面。

材料與儀器

新鮮豚鼠血
Hanks液小牛血清 199培養液生理鹽水氯化鈉溶液
離心管離心機

步驟

1. AET-RRBC制備

（1）AET溶液的制備

稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，使成為0.143 M 溶液，用4N NaOH溶液調pH9.0。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。

（2） AET處理RRBC

取洗滌好壓積的RRBC，按一份壓積AET—RRBC加入4份新鮮配制的pH9.0的AET溶液充分混勻置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口（1~2厘米）1800轉/分離心5分鐘。連續洗滌3-5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET-RRBC粘附成團，并觀察有無溶血。若有溶血現象，則用含小牛血清的199培養基再洗一次，最后配成10%AET-RRBC懸液，置4℃保存，不得超過5天。

（3）1%AET-RRBC的配制：

將預先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET-RRBC，以含10%小牛血清的199培養液稀釋至1%。

2. 從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞，操作見后試驗。

3. AET—E花環試驗：

將分離的單個核細胞（2x106/毫升）與等量1%AET-RRBC混合，置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數管，每管2—3毫升，低速離心（1000轉/分鐘）5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。

4. T淋巴細胞和B淋巴細胞的分離

將形成E-花環的細胞懸液，再用淋巴細胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細胞，即為富含B淋巴細胞群。沉淀于管底的E-花環，用Hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E-花環周圍的RRBC，立即加3.5%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含T淋巴細胞群。

注意事項

1. 分離B細胞過程較長，為了避免B細胞自然死亡，在最后沖洗B細胞時可以用1640,而且要加入5一10%的小牛血清。

2. 每次洗滌時，不要將試管底部液體吸干，即防止壓積的B細胞接觸空氣。

3. 使用抗B淋巴細胞血清與受檢細胞按NIH方法進行微量B細胞毒試驗，使用倒置相差顯微鏡讀數。

常見問題

關于從小鼠脾臟中分離：

1.脾臟組織所含結締組織比較少，可以直接在篩網上研磨，無需剪碎，也不用顧慮血管。

2.ficoll中含多聚糖，所以許多人喜歡把它放4度存放，是否室溫對實驗影響不大脾臟分離淋巴細胞實驗比較簡單，所以用普通的淋巴細胞分離液就行。

3 .離心2000rpm×20min，這步很關鍵，還有就是加細胞懸液時一定要貼壁緩慢加入，不要破壞分界面，分離液與細胞懸液我常用1：2，還有就是所選用的離心管粗細也會影響分層。

4.中間的懸浮白色環狀細胞層即是所要的淋巴細胞層。

5.洗細胞主要是洗去分離液，所以不能省去。

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