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荷花花粉檢測
蓮別稱荷花，是蓮科(Nelumbonaceae)蓮屬(Nelumbo)的多年生挺水植物，是最古老的雙子葉植物之一，目前僅存有美洲蓮(Nelumbolutea)和亞洲蓮(N.nucifera)2個種。荷花集觀賞、食用、藥用等功能于一體，具有重要的文化價值、經濟價值、生態價值[1-2]。
花粉是植物體上起生殖作用的雄配子體[3]，其活力直接影響到植物受精和結實過程，較高的花粉活力可以提高植物的結實率和育種成效。荷花花粉含有豐富的類黃酮，目前針對荷花藥用價值的研究較多[4-5]，而對其活力的研究較少[6]。目前已有的2000多個荷花品種主要由中國和日本培育而成[7]，育種方法主要是自然雜交和人工雜交，少部分采用物理或化學誘變方法[8-10]，然而在荷花雜交過程中常出現不結實或結實率低的問題。因此，了解花粉活力情況對于荷花雜交育種過程至關重要，如不同種類的荷花花粉活力是否存在差異及差異多大，如何更有效地檢測荷花的花粉活力，如何更有效地儲藏花粉使其活力保存較長時間等問題目前尚不清楚。
離體培養法和染色法是測定植物花粉活力的常用方法，已經在百合[11]、牡丹[12]、巴旦木[13]、菊花[14]、君子蘭[15]等植物中得到了廣泛應用。本研究以不同資源荷花的花粉為試驗材料，分別采用離體培養法、碘-碘化鉀(I2-KI)染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法進行活力檢測，以離體培養法作為參照，比較2種染色方法的測定結果，從而對不同資源荷花的花粉活力進行比較分析。
在對荷花進行人工雜交前，先對花粉活力進行準確有效的檢測，選出花粉活力強的品種作為父本，進而選擇合適的雜交母本，是保證雜交育種工作順利開展和提高效率的重要條件。本研究期望得出有效、快速地檢測荷花花粉活力的方法，從而篩選出花粉活力較高的荷花品種，為荷花新品種的高效培育奠定基礎。
1材料與方法
1.1試驗材料
表1中的試驗材料為取自上海辰山植物園國家荷花資源圃的11份不同資源的荷花，包括美洲蓮、亞洲蓮及亞美雜交蓮，均為單瓣型(圖1)，因考慮到單瓣型荷花雄蕊發育正常，花粉活力通常更高。試驗材料采集時選擇天氣晴朗的08：00左右，選取開花第2天的荷花，荷花花蕾在開花前用種子袋套上，避免因蜜蜂采蜜導致授粉雜交。試驗于2020年7—9月在上海辰山植物園中國科學院上海辰山植物科學研究中心的觀賞植物資源及創新利用研究組247實驗室內完成。
1.2試驗方法
1.2.1花粉的收集用一次性唇刷將花粉從花藥上輕刷下來，放在培養皿中的硫酸紙上，蓋上培養皿備用。
1.2.2培養基的選擇影響花粉萌發的主要因素有蔗糖、硼酸等[16]。聚乙二醇(PEG)可以促進種子萌發[17]，也可以使花粉緩慢水合，從而較長時間地維持花粉膨壓，對花粉萌發也有一定的促進作用[18-20]。由前期的試驗結果可知，荷花在固體培養基上的萌發率較低，結合孫春青等的方法[21]，最終選用液體培養基。
為了得到適用于大多數荷花花粉萌發的培養基，設置PEG-4000(含量分別為0、10%、15%)、蔗糖(含量分別為0、5%、10%)、硼酸(含量分別為0、0.01%、0.02%)3個因素的3個水平，共設計15種組成不一的培養基(表2)，并選擇3個荷花品種的花粉做培養基篩選試驗，分別為粉霸王、易建蓮、巨姚。分別將3個荷花品種的花粉撒于15種培養基上，在培養箱中于30℃培養4h后，使用奧林巴斯BX43正置顯微鏡，在放大10倍的條件下觀察花粉的萌發情況，統計萌發率。在離體培養法中，當花粉管的長度大于花粉粒的直徑時視為萌發[22]。
1.2.3離體培養法配制培養基，將培養基置于干凈的凹面載玻片上，取花粉均勻撒在培養基上，然后將其放入內置濕潤濾紙的培養皿中，在培養箱中于30℃培養4h后，鏡檢觀察花粉的萌發情況，統計萌發率。每個處理設置3個重復，每個重復觀察3個視野。
1.2.4I2-KI染色法配制I2-KI溶液(稱量0.2gKI溶于8mL蒸餾水中，充分溶解后，加入0.1gI2定容至30mL，振蕩使其充分溶解)于棕色滴瓶中，避光備用。取適量花粉于PCR管中，將PCR管用錫箔紙包裹避光，再向管中加入200μLI2-KI溶液，輕輕振蕩混勻，然后在黑暗條件下染色5min。滴2～3滴染色液于載玻片上，鏡檢觀察，被染成藍色的花粉視為有活力，未被染色的花粉則視為無活力。上述每個處理設置3個重復，每個重復觀察3個視野。
1.2.5TTC染色法配制0.5%TTC溶液(稱量0.05gTTC溶于10mL磷酸緩沖液中)于棕色滴瓶中，避光備用，溶液需現配現用。取適量花粉于PCR管中，將PCR管用錫箔紙包裹避光，再向管中加入200μLTTC溶液，輕輕振蕩混勻，然后放入37℃培養箱中黑暗染色15min。滴2～3滴染色液于載玻片上，鏡檢觀察，被染成紅色的花粉是有活力的，未被染色的花粉是無活力的。上述每個處理設置3個重復，每個重復觀察3個視野。