5
小鼠脾臟樹突細胞的分離－塑料黏附和EA玫瑰花結富集DC
實驗材料：
1. 膠原酶消化的脾臟細胞懸液
2. 高密度牛血清白蛋白（BSA）溶液
3. RPMI 1640培養基（如Life Technologies），4℃和37℃
4. RPMI-5*培養基，4℃和37℃
5. 抗體偶聯的綿羊紅細胞（EA）
6. 用于流式細胞分析的一抗
7. 用于流式細胞分析的二抗（熒光結合的小鼠抗大鼠IgG和IgM；如Boehringer Mannheim）
8. Beckman GH-3.7和Sorvall HS-4轉子
9. 15ml和50ml聚丙烯錐底管
10. 填充棉花和未充填棉花的高壓滅菌的9in（約23cm）巴氏吸管，直徑60mm的組織培養皿（如Falcon）
實驗方法：
1. 將膠原酶消化的脾臟細胞懸液于4℃，280g離心10min，棄上清。用高密度BSA迅速重懸沉淀物，每個脾臟約1ml。
2. 準備BSA柱：將5-6ml細胞懸液加入15ml離心管中，在懸液上小心加入4℃ 1.5ml的RPMI-1640培養基，形成一明細界面。用此種方法準備4或5個BSA柱，直至分完細胞懸液。
3. 將BSA柱于4℃，9500g離心15min，緩慢加速，注意關掉“brake"開關。
4. 小心地用填充棉花的巴氏吸管收集分界面得細胞，吸走全部的RPMI-1640和頂部1ml BSA，將細胞轉移至另一干凈的50ml離心管中（棄沉淀）。用4℃的RPMI-1640充滿離心管以稀釋BSA，緩慢搖動混勻。
5. 于4℃，280g離心10min后棄上清。重懸細胞于5-10ml RPMI-5*培養基后置于冰上。
6. 臺盼藍染色計數活細胞（一個脾臟可得到107個低密度的脾臟細胞）。
7. 用RPMI-5*培養基調整細胞密度至大約107個細胞/ml。每4ml懸液接種至60mm培養皿內直至全部細胞鋪板完畢。培養90min使DC粘附。
8. 棄非粘附細胞：用充填棉花的巴氏吸管吸取37℃ RPMI-1640培養基，小心清洗培養皿表面，去除懸浮的細胞，直至培養皿表面由粗糙渾濁變為光滑并近乎清亮。重復洗滌一次。
9. 每個培養皿加入4ml 37℃ RPMI-1640培養基并培養30-60min以去除粘附的淋巴細胞。重復步驟8。
10. 于倒置顯微鏡下利用相差觀察培養皿。可見大部分深色星形樹突細胞、一些明亮扁平的巨噬細胞，以及淋巴細胞、單核細胞之類的圓形細胞。如果樹突細胞比例不高，則重復步驟8、9。
11. 用4ml干凈的RPMI-5*培養基替換每個培養皿中的液體，培養12-20h。
12. 用填充棉花的巴氏吸管吸取37℃ RPMI-5*培養基洗滌平皿。將洗下來的細胞轉移入置于冰上的15ml離心管中（每管可裝3個平皿的洗滌細胞）。用2ml RPMI-5*培養基洗滌平皿。重復該操作直到培養皿內的細胞收集完畢。
13. 將收集的細胞于4℃，280g離心10min，棄上清。用1ml干凈的RPMI-5*培養基重懸細胞后置于冰上。
14. 臺盼藍染色計數活細胞（0.5×106-1.0×106個細胞/脾臟，約80%為DC）。
15. 按每個白細胞50個EA（抗體偶聯的綿羊紅細胞）的量加入EA（以結合B細胞和巨噬細胞），顛倒混勻。4℃，70g離心10min。離心后不棄上清，直接將離心管置于冰上30min。
16. 吸棄部分培養基，剩下2-2.5ml。用填充棉花的巴氏吸管輕微吹打細胞懸液10-15次以吹散大的團塊但是不破壞玫瑰花結。
17. 將重懸的細胞用血球計數器檢查以確認是否每個玫瑰花結都是一個白細胞周圍圍繞著紅細胞。如果有必要，再次懸浮細胞。
18. 制備BSA柱：將5ml高密度的BSA加入至15ml的離心管中，小心地將2.5ml玫瑰花結懸液加到液面上，從而形成一清晰地界面。
19. 離心并收集細胞同步驟3-6（2×105-7×105個細胞/脾臟，大于95%為DC）。
20. 用一抗標記DC用流式細胞儀檢測其純度。對于二抗，用熒光結合的小鼠抗大鼠IgG和IgM。
附錄：
抗體偶聯的綿羊紅細胞（EA）：
以PBS洗滌2.5ml收集的綿羊紅細胞（Alsever液中提取；Cocalico）3次，每次洗滌后均以350g離心5min。然后用新鮮PBS稀釋為5%細胞懸浮液（109個細胞/ml）。將高致敏的兔抗紅細胞血清于5%細胞懸液以1：50稀釋（可能形成亞凝集劑量的抗體）。室溫下孵育2h，偶爾溫和地顛倒溶液。用RPMI1640（Life Technologies）洗滌形成的EA3次，隨后以PBS將EA稀釋為5%細胞懸液。于4℃保存2周，使用前再以RPMI洗滌一次。
RPMI-5*培養基：
RPMI1640培養基（Life Technologies），含有：
5%FBS，56℃熱滅活1h
10mmol/L HEPES
20mg/ml硫酸慶大霉素（Life Technologies）
50mmol/ml 2-ME
過濾除菌
高密度BSA溶液：
在1L容量瓶中，加入186ml PBS，29ml 1mol/L NaOH，65ml水（小心操作，注意液體不要再瓶內飛濺）。不要攪拌，將106g BSA（Cohn fraction V，推薦采用*BSA）鋪在溶液表面，蓋上錫紙，冷藏過夜，使BSA慢慢溶解。
第二天，溫和搖晃已變為澄清、微褐色的溶液；測量折射指數，精確到小數點后第四位。25℃條件下，正確密度的BSA（1.080g/ml）的折射指數在1.384-1.385。為校正折射指數后，用試紙檢測pH。pH應在7.0-7.4，一般無需調整。
無菌過濾溶液。將47mm濾膜（Millpore type）置于一個500ml的過濾裝置（Nalgene#156-4045）頂部，先以少量BSA潤濕濾膜。真空抽濾數分鐘，直到BSA濾出為止。取下真空泵，小心將剩余的BSA溶液加入濾器上部的儲存器中（避免起泡沫。使用真空泵和濾器過濾剩余的BSA，≥10min）。4℃可保存3個月。