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原代細胞培養技術
一、組織塊直接培養法
1、取材,用Hank's液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
2、用手術剪將組織剪切成1mm3左右的小塊,再用Hank's液洗三次。
3、將組織塊轉移至培養瓶,并貼附于瓶底面。
4、輕輕將培養瓶翻轉,瓶底朝上,向瓶內注入適量的培養液,將培養瓶放置在37℃恒溫箱內培養。
5、放置待組織小塊貼附后,將培養瓶慢慢翻轉平放,使組織浸入培養液中(勿使組織漂起),37℃繼續培養。
二、消化培養法
1、取材,用Hank's液洗滌三次,并剔除脂肪,結締組織,血液等雜物。
2、用手術剪將組織剪切成1mm3左右的小塊,再用Hank's液洗三次。
3、視組織塊量加入酶液,37℃中消化20—40分鐘,每隔5分鐘振蕩一次,或用吸管吹打一次,使細胞分離。
4、加入3—5ml培養液以終止酶消化作用(或加入相關酶抑制劑)。
5、靜置5—10分鐘,使未分散的組織塊下沉,取懸液加入到離心管中。
6、1000rpm,離心10分鐘,棄上清液。
7、加入Hank's液5ml,沖散細胞,再離心一次,棄上清液。
8、加入培養液1—2ml(視細胞量),血球計數板計數。
9、將細胞轉移到培養瓶中,37℃下培養。
三、 器官培養
1、將不銹網做成支架形狀,調整其高度至培養皿的1/2深度平面,在其表面放置0.5μm孔徑濾膜。
2、將培養液加入培養皿中,使液面剛剛接觸到濾膜,但不要使其浮起。
3、將要培養器官組織放在濾膜上,一般厚度不要超過200μm,水平面積不超過10mm2。
4、將上述準備好的培養物放入CO2培養箱,并加注氧氣調整氧分壓,最好到90%。
5、培養過程中要注意觀察培養液平面,盡可能保持在與濾膜一致的水平上。
6、上述可進行器官培養1-3周,每2-3天換液一次,并根據情況做進一步實驗和檢測。