氨基比林-N-去甲基化酶（AND）活性檢測試劑盒（微量法）

注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定。

產品貨號：BA1046

產品規格：100管/48樣

產品簡介：

細胞色素P450酶是一組在外源物質代謝中，尤其是藥物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作為P450酶系的重要一員，相當于CYP3A4亞型，與藥物的去甲基化反應密切相關。

AND催化氨基比林釋放甲醛，通過Nash比色法測定甲醛含量，即可計算出AND活性。

產品組成：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加100mL蒸餾水充分溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1管，4℃避光保存。臨用前加入1mL無水乙醇，充分溶解。

試劑四：粉×1管，4℃保存。臨用前加入0.5mL蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加蒸餾水4mL充分溶解。

試劑六：液體×1瓶，室溫保存。

試劑七：液×1瓶，4℃保存。

標準液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5mLEP管，加入10µl標準液，加990µl蒸餾水，混勻即為0.05mmol/L標準甲醛溶液，4℃保存。

需自備的儀器和用品： 

普通離心機，超速離心機、水浴鍋、可調式移液槍、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、蒸餾水、無水乙醇和冰。

操作步驟：

一、粗酶液提取： 

1. 除去細胞核，線粒體等大分子物質：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10000g 4℃離心30min，取上清液轉入超速離心管。

2. 粗制微粒體：4℃，100000g，離心60min，棄上清液。

3. 除血紅蛋白等雜質：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100000g離心30min，棄上清液。

4. 最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，待測。該待測液需當天使用。

二、AND活性測定步驟： 

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長到412nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預熱30min。

3. 對照管：取1支EP管，加入10µL粗酶液，170µL試劑二，10µL試劑三，10µL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35µL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35µL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入100µL上清液，100µL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A對照管。

4. 測定管：取1支EP管，加入10µL粗酶液，170µL試劑二，10µL試劑三，10µL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入35µL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入35µL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入100µL上清液，100µL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測定光吸收，記為A測定管。

5.  標準管：取1支EP管，加入100µL標準品，100µL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷

卻5min，于412nm測定光吸收，記為A標準管。

注意：每個樣品都需要做對照管。

三、AND活性計算： 

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C標準品×V標準品×(A測定管－A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T

=45×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷Cpr。

（2）按樣本質量計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/g鮮重)=C標準品×V標準品×(A測定管－A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(V樣÷V樣總×W)÷T

 =22.5×（A測定管－A對照管）÷A標準管÷W。

C標準品：0.05 mmol/L=50µmol/L；

V標準品：100µL=0.0001 L；

稀釋倍數：V反總÷V上清液=（10+170+10+10+35+35）÷100=2.7；

Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；

V樣：加入粗酶液體積，10µL=0.01mL；

V樣總：提取液體積，0.5mL；

W：樣本質量，g ；

T：催化反應時間（min），30min。

b. 使用96孔板測定的計算公式如下

（1）按蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每毫克蛋白催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C標準品×V標準品×(A測定管－A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷（Cpr×V樣）÷T

=45×（A測定管－A對照管）÷ A標準管÷ Cpr。

（2）按樣本質量計算

活性單位定義：37℃中每分鐘每克組織催化產生1nmol甲醛為1個酶活單位。

AND活性(nmol/min/g鮮重)=C標準品×V標準品×(A測定管－A對照管)÷A標準管×稀釋倍數÷(V樣÷V樣總×W)÷T =22.5×（A測定管－A對照管）÷ A標準管÷W。

C標準品：0.05 mmol/L=50µmol/L；

V標準品：100µL=0.0001 L；

稀釋倍數：V反總÷V上清液=（50+850+50+50+175+175）÷500=2.7；

Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量測定試劑盒；

V樣：加入粗酶液體積，10µL=0.01mL；

V樣總：提取液體積，0.5mL；

W：樣本質量，g ；

T：催化反應時間（min），30min。

注意事項：

1. 粗酶液需在當日完成測定，如需保存，則向粗酶液提取步驟3的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分裝后，-80℃保存；

2. 試劑三和試劑四需臨用前配制，如當天沒有用完，4℃避光保存，可用1周；

3. 粗酶液可直接用于蛋白濃度測定，建議用BCA法測蛋白含量。