TaqMan One Step RT-qPCR Kit

產品貨號：T11239

產品規格：50T/200T

產品介紹:

TaqMan One Step RT-qPCR kit （qRT-PCR Probe）是一步法（One Step）RT-PCR熒光定量探針法定性、定量反應的專用試劑，反應過程在同一管內連續進行，避免開管，能有效防止污染。本品含有高溫反轉錄酶（RNase H-）和新型熱啟動酶，具有更高的反轉錄和PCR擴增效率，適合于低濃度RNA模板的高靈敏度擴增。本試劑采用優化配方的專用Buffer，可以在較寬的定量區域內得到良好的標準曲線，準確進行定量，并與多數廠家的熒光定量PCR 儀兼容，如Applied Biosystems、 Eppendorf、Bio-Rad和Roche等。

試劑組成：

25×One Step RT-qPCR RTase mix

5×One Step RT-qPCR Buffer

10×Enhancer

試劑原理： 

TaqMan One Step RT-qPCR kit首先利用反轉錄酶RTase將RNA反轉錄成cDNA，再以cDNA為模板通過熱啟動DNA擴增酶在單管閉管反應體系中連續進行PCR擴增反應，利用熒光標記探針（Probe）水解發光，并對發光信號進行檢測。

1. RT-PCR

首先采用反轉錄酶以RNA為模板合成cDNA，然后再以合成的cDNA為模板，經過PCR擴增反應的熱變性、引物退火、鏈延伸三個步驟循環往復，在短時間內擴增得到大量DNA片段。

2. 熒光檢出

TaqMan探針法是使用5’端帶有熒光物質，3’端帶有淬滅物質的TaqMan探針進行熒光檢測的方法。在探針沒有被 Taq酶分解時，5’端的熒光物質受到3’端淬滅物質的制約，不能發出熒光。而當TaqMan探針被分解后，5’端的熒光物質便會游離出來，發出熒光。在PCR反應液中加入熒光探針后的退火過程中，熒光探針便會和模板配對區域結合。在PCR反應的延伸過程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’ 核酸外切酶活性可以分解和模板雜交的熒光探針，游離出的熒光物質便會發出熒光。通過檢測反應體系中的熒光強度，可以達到檢測PCR產物擴增量的目的。

反應條件： 

1. PCR 程序（兩步法）

反轉錄：50℃ 20分鐘；

變  性：95℃ 3分鐘；

變  性：95℃ 10~20秒；

退火/延伸：60℃ 20~60秒

2. PCR 程序（三步法）

反轉錄：50℃ 20分鐘；

變  性：95℃ 3分鐘；

變  性：95℃ 10~20秒；

退  火：56-64℃ 10~30秒；

延  伸：72℃ 10~60秒。

RT-PCR 反應體系配制

1. 通常引物終濃度為0.2µM可以得到較好結果。反應性能較差時，可以在0.1～1.0µM范圍內調整引物濃度；

2. 通常探針濃度可在0.1～0.3µM范圍內優化。可進行濃度梯度的實驗，尋找引物和探針的最佳組合。探針的使用與 Real Time PCR擴增儀、探針種類、熒光標記物質種類有關，請參照儀器說明書或各熒光探針的具體使用要求進行；

3. 不同種類的模板中含有的靶基因的拷貝數不同，必要時可進行梯度稀釋，確定最佳的模板添加量。

質量控制： 

1. 功能檢測：qPCR的敏感性、特異性、可重復性；

2. 無外源核酸酶活性，無外源內切、外切核酸酶污染。

技術說明： 

1. 該體系常用50℃進行反轉錄反應，可以在45℃~60℃范圍內進行反轉錄溫度優化；根據反應特征不同，可以在5~30分鐘內對反轉錄時間進行優化；

2. 該體系所用的反轉錄酶是在MMLV基礎上進行了基因改造，去除了RNaseH活性，使其具有更高的溫度耐受性和反轉錄溫度，對RNA復雜結構模板具有更高的反轉錄效率；

3. 該體系具有更好的體系穩定性和適用性，非常適合于病毒類、組織提取RNA復雜模板的檢測；對極限濃度模板的擴增效果更加穩定。

保存：

-20℃保存長期保存，使用前應混勻，避免反復凍融。