DH10Bac：                                                100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                   10μl

保存條件(保質期)：                            -80℃（6個月） 

基因型

F- mcrA ?(mrr-hsdRMS-mcrBC) ?80lacZ?M15 ?lacX74 recA1 endA1 araD139 ?(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG /pMON14272 / pMON7124

產品說明

DH10Bac菌株主要用于生產重組桿狀病毒分子（Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統）。該菌株中含有父本桿粒 bMON14272 、輔助質粒 pMON7124 ：父本桿粒 bMON14272包含 mini-F復制子, 卡那抗性基因, attTn7 位點和 lacZα互補因子；輔助質粒 pMON7124 含有 tnsABCD區（tnsABCD region supplies the transposition proteins required for insertion of the mini-Tn7 from the donor plasmid into its target site on the parent bacmid），具有四環素抗性，在細胞擴增過程中丟失，但可提高供體質粒pFastBac（具有慶大霉素抗性）轉化后的基因轉座效率。mcrA、mcrBC及mrr突變使DH10Bac菌株適合于克隆富含甲基胞嘧啶或甲基腺嘌呤的DNA（Therefore , genomic DNA , both  prokaryotic and eukaryotic, can be cloned efficiently in DH10Bac）。recA1和endA1的突變有利于插入DNA的穩定和高純度質粒DNA的提取。?80lacZΔM15 的存在使DH10Bac可用于藍白斑篩選，DH10Bac感受態細胞經特殊工藝制作，pUC19質粒檢測轉化效率>10⁸cfu/μg DNA。

操作方法

供體質粒（pFastBac等）轉化重組方法：

1. DH10Bac感受態細胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入供體質粒（pFastBac等）1ng，并用手打EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。

3. 向離心管中加入900μl不含抗生素的SOC液體培養基，37℃，225 rpm復蘇4小時。

4. 復蘇完成后，用SOC稀釋轉化液到（10-1，10-2），每個稀釋用吸取100ul鋪一個LB平板（共涂3個平板），平板包含50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG。

5. 將平板倒置放于37℃培養箱48h（抗生素含量較高，需在37度長時間培養才能挑到合適克隆）。

  陽性驗證：

  1. 挑10個白色的克隆，重新劃線在LB平板（50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。37度過夜培養。

2. 挑選白色的克隆，轉接到含有50ug/ml Kan，7ug/ml Gentamicin，7ug/ml tetracycline的LB培養液中，過夜培養。

3. 使用試劑盒（QIAGEN cat. 12162）或異丙醇-醋酸鈉法抽提重組質粒DNA（＞100kb）。使用PCR法分析重組質粒是否正確重組。

pUC19檢測轉化效率方法：

1. DH10Bac感受細胞態從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA（質粒或連接產物）并用手撥EP管底混勻，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動會降低轉化效率。

3. 向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養液LB，37℃，200 rpm復蘇60分鐘。

4. 取100μl轉化液涂布到含50-100ug/ml氨芐的LB平板上。

5. 將平板倒置放于37℃培養箱12-16h，統計計算轉化效率。

注意事項

1. 感受態細胞好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內加入目標DNA，不可在冰中放置時間過長，長時間存放會降低轉化效率。

2. 轉化高濃度的質粒可相應減少終用于涂板的菌量。

3. 涂板時務必涂干，平板表面不留任何水份。