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雙熒光素酶檢測報告實驗步驟及原理

一、實驗原理

利用熒光素酶與底物結合發(fā)生化學發(fā)光反應的特點，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，構建成熒光素酶報告質粒。然后轉染細胞，適當刺激或處理后裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷性刺前后或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。

同時，為了減少內在的變化因素對實驗準確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase)的質粒作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄活力的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。

二、實驗材料

1. 實驗器材

名稱	廠家	型號
離心機	Thermo	MICROCL 17
水浴鍋	北京君意東方設備有限公司	JY300
紫外分析儀	北京君意東方設備有限公司	JY02S
GloMax發(fā)光檢測儀	Promega	96孔
分光光度計	上海舜宇恒科學儀器有限公司	752
二氧化碳培養(yǎng)箱	Thermo	3111
旋渦震蕩儀	其林貝爾	QL-861
微量移液器	德國Eppendorf公司	\
Aquapro超級純水儀	艾科浦	AJY -0501
生物安全柜	蘇凈安泰	BS-1300IIA2
倒置熒光顯微鏡	OLYMPUS	CKX41

2. 試驗主要試劑

名稱	廠家	貨號
Dual-Luciferase® Reporter Assay System	Promega	E1910
24孔板	Corning	3599
DMEM 培養(yǎng)基	Gibco	11995065
胎牛血清FBS	Gibco	10099141
胰酶	Gibco	25200-056
磷酸鹽緩沖液	Gibco	10010023
青霉素-鏈霉素	Gibco	15140122

 

三、實驗操作步驟：

DLA檢測

1. 細胞培養(yǎng)及細胞傳代

1. 倒置顯微鏡觀察細胞，評估細胞匯合的程度以及確認無細菌和真菌污染；
2. 移去培養(yǎng)皿（瓶）中的培養(yǎng)液；
3. 加入相當于培養(yǎng)液體積一半的PBS清洗單層細胞，一般三次即可；
4. 按1ml/25cm2表面積的量加入0.25%胰酶消化單層細胞。搖晃培養(yǎng)皿（瓶）使其胰蛋白酶覆蓋細胞單層，倒出多余的胰蛋白酶；
5. 將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱，放置2-10 min;
6. 用倒置顯微鏡觀察細胞以確保所有細胞都分離且漂浮，輕拍培養(yǎng)皿（瓶）的一側來釋放殘留的貼壁細胞；
7. 用少量的含新鮮血清的培養(yǎng)液重懸細胞以滅活胰蛋白酶，取出100-200μl用于計數(shù)；
8. 將所需數(shù)量的細胞移至一個新標記好的溫育過培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿（瓶）中；選擇適當培養(yǎng)條件培養(yǎng)細胞系；
9. 按照細胞系的生長特性重復該步驟，知道細胞狀態(tài)良好、無污染，可以鋪板使用，其余選擇凍存。

1. 活細胞計數(shù)

1. 取一瓶傳代的細胞，待長成單層以后使用；細胞懸液的制備方法：用0.25%的胰酶消化、PBS洗滌后，加入培養(yǎng)液吹打制成待測細胞懸液。
2. 蓋好蓋玻片，取一套血球計數(shù)槽，制備計數(shù)用的細胞懸液：用吸管吸適量細胞懸液到離心管中，加入等體積臺盼藍染液，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。若僅是單純的進行細胞計數(shù)，不考慮細胞的活力，則可不使用臺盼藍染色。
3. 將細胞懸液滴入計數(shù)板，注意蓋玻片下不要有氣泡，也不要懸液流入旁邊槽中。
4. 統(tǒng)計四個大格的細胞數(shù)，將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，當看到鏡中出現(xiàn)計數(shù)方格后，數(shù)出四角的大格（每格含有16個中格）中沒有被染液染上色的細胞數(shù)目。
5. 計算原細胞懸液的細胞數(shù)。按照下面公式計算細胞密度：
6. （細胞懸液的細胞數(shù)）/ml = (四個大格子細胞數(shù)/4）×2×10⁴

1. Dual-Luciferase® Reporter Assay試劑盒檢測步驟

1. 細胞轉染：按照上述實驗分組的情況，采用lipo2000轉染試劑盒的方法進行質粒轉染，轉染12小時后更換新鮮培養(yǎng)基；
2. 樣品裂解：轉染72小時后PBS清洗細胞兩次，每孔加入250ul 1×PLB裂解液，搖床上裂解細胞；
3. 樣品檢測：在96孔黑色板中加入100ul的LAR II試劑，后加入20ul的裂解液后檢測讀數(shù)；
4. 內參檢測：10s內加入100ul的Stop & Glo底物，檢測讀數(shù)；
5. 結果分析：導出數(shù)據(jù)后采用GraphPad prism 5軟件進行結果分析并制圖；