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小鼠心肌成纖維細胞分離模型科研實驗技術服務介紹

時間:2024/8/2閱讀:92

小鼠心肌成纖維細胞分離模型


       小鼠心肌成纖維細胞的組織來源于實驗動物的正常心臟組織,心臟是脊椎動物身體中最重要的一個器官,主要功能是提供壓力,把血液運行至身體各個部分。心臟的作用是推動血液流動,向器官、組織提供充足的血流量,以供應氧和各種營養物質,并帶走代謝的終產物(如二氧化碳、無機鹽、尿素和尿酸等),使細胞維持正常的代謝和功能。心臟中,心肌成纖維細胞約占正常心肌組織細胞總數的60%-70%,是心臟中非心肌細胞的主要組成部分,廣泛存在于心臟組織中,包圍心肌細胞,連接心肌細胞間質,與缺血性心臟病、炎癥、肥大、梗死等病理狀態密切相關。細胞生長方式以長梭狀細胞,貼壁培養。


小鼠心肌成纖維細胞分離模型




動物品系:大 小鼠


實驗分組:正常對照組、模型組、陽性藥組、受試藥組低、中、高三個劑量組


實驗周期:N


建模方法:


1. 小鼠頸椎脫臼處死后,剃除腹胸部的被毛,放入裝有75%酒精的燒杯中浸泡5min。


2. 取出小鼠,在無菌環境下打開胸腔,取出心臟組織,注入盛有無菌1×PBS的培養皿中,洗凈組織表面的血液。


3. 將清洗干凈的心臟組織轉入裝有75%酒精的培養皿中浸泡15s以殺死大多數的心臟被膜細胞,浸泡完成后立即轉入裝有無菌1×PBS的培養皿中震蕩清洗。


4. 清洗完成后,用剪刀鑷子配合除去主動脈弓和心房組織,僅保留心室部分,再次用1×PBS清洗去除心室內的血液。


5. 將清洗干凈的心室組織用剪刀減成1mm3大小左右的碎塊,之后用PBS清洗若干次后按下述兩種方法之一進行后續操作。


A. 貼塊法


6. 將清洗好的碎塊轉入另一培養皿中,用0.25%胰蛋白酶消化液浸泡組織,室溫消化3-5 min。


7. 消化完成后,添加數毫升FBS終止消化,之后吸棄液體,加PBS清洗組織塊1伺次后,用200 ul吸頭將組織塊平均接種于T-25培養瓶的培養面上,之后將培養瓶放置于37℃二氧化碳培養箱中,靜置2-4h。


8. 待組織處于略微脫水的狀態時,小心添加2ml萬全培養基,添加時注意盡量不要將組織塊沖起,要使培養基接觸所有的組織塊。


9. 之后放入培養箱中繼續培養,一般2-4天后成纖維細胞會從組織塊周圍爬出,待爬出的細胞有較多數量時,可將細胞消化下來,去除組織塊,轉入另一培養瓶中培養。


B. 消化法


6. 將清洗好的碎塊轉入另一離心管中,加入混合消化液(0.08%胰酶+0.06%Ⅱ型膠原酶)37℃水浴消化8 min后,吸取上層混懸液棄去。


7. 余下組織加入混合消化液10 ml,37℃水浴震蕩消化10 min;吸取上層懸液至另一離心管中,加入適量FBS終止反應;剩余沉淀物再加消化液消化3-5次,直至組織塊萬全消化。


8. 按1∶1加入含血清的培養基,中止酶反應,懸液過200目網篩去除較大的組織塊。


9. 收集全部中止后的消化液于離心管中,300g,離心10 min,棄去上清,加入培養液重懸細胞后計活細胞數。


10. 調整細胞密度以1× 106個/ml 接種入的T-25培養瓶中,每瓶添加2 ml細胞懸液。


11. 培養瓶放置于37℃,5% 二氧化碳培養箱中靜置40min后,吸棄上清液以去除未貼壁的非成纖維細胞和死細胞,再添加5 ml萬全培養基繼續培養。


三 傳代步驟


如果細胞密度達80%-90%,即可進行傳代培養。


1. 棄去培養上清,用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。


2. 加2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培養瓶中,置于37℃培養箱中消化1-2分鐘,然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況,若細胞大部分變圓并脫落,迅速拿回操作臺,輕敲幾下培養瓶后加少量培養基終止消化。


3. 按6-8ml/瓶補加培養基,輕輕打勻后吸出,在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養液后吹勻。


4. 將細胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。


四 復蘇步驟


將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,棄去上清液,補加1-2mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜(或將細胞懸液加入10cm皿中,加入約8ml培養基,培養過夜)。第二天換液并檢查細胞密度。


五 凍存步驟


待細胞生長狀態良好時,可進行細胞凍存。下面T25瓶為例:


1. 細胞凍存時,棄去培養基后,PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶,細胞變圓脫落后,加入2ml萬全培養基終止消化,可使用血球計數板計數。 


2. 1000RPM離心5分鐘去掉上清。用血清重懸浮,加DMSO至最終濃度為10%。加入DMSO后迅速混勻,按每1ml的數量分配到凍存管中,注意凍存管做好標識。本公司按每個凍存管細胞數目大于1X10^6個細胞凍存。


3. 將凍存管置于程序降溫盒中,放入-80度冰箱,至少2個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。


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