隨著反相快速色譜法在反應混合物純化中的使用增加，出現了很多問題，因為許多化學家不像正相或硅膠柱色譜法那樣熟悉這項技術。化學家提出的問題之一是關于 pH 調節劑（特別是酸）的使用及其純化。
在反相占主導地位的 HPLC 領域，通常使用酸（甲酸、乙酸等），通常濃度為 0.1%。其基本原理是，如果樣品成分在溶液中可電離，則其色譜保留和峰形可能會受到影響，并且其定量也會受到挑戰。
電離/可電離化合物在溶液中時在帶電狀態和中性狀態之間保持平衡。這些分子在中性溶劑系統中進行色譜分析時，可以顯示為前峰（想想滑雪坡），因為電離部分比中性狀態更易溶于水，因此洗脫得更快。添加 pH 調節劑，無論是酸還是堿，都可以迫使平衡全進入中性狀態或進入電離狀態。當全電離時，化合物會提前洗脫；當中性時，該化合物更具疏水性，并且其在柱上的保留增強。
例如，我們來看看通過琥珀酸酐和 α-甲基芐胺的微波反應生成的合成 N-(1-苯乙基)琥珀酰亞胺的純化，如圖 1 所示。
圖 1. 使用 Biotage® Initiator+ 微波反應器進行琥珀酸酐與 α-甲基芐胺的反應
當使用中性溶劑純化時，產品前沿很差，表明它處于電離態和中性態之間的平衡，圖 2。
圖 2. 使用中性水和乙腈的反應混合物反相快速色譜顯示前沿產物峰。
產品作為非高斯前沿峰洗脫的問題是，它是一個寬廣的峰，并且收集在多個柱體積 (CV) 中。這意味著收集的產物被稀釋在比典型或期望更多的溶劑中，這增加了蒸發餾分溶劑的體積和時間，并增加了較低純度和回收率的可能性。事實上，該反應混合物中存在較早洗脫的副產物，其污染了早期產物級分。是的，這些餾分可以被丟棄，但這會降低回收的產品產量，這不一定是理想的解決方案。
通過將酸（在本例中為0.2%冰醋酸）引入到水和乙腈中，可電離的反應混合物組分質子化。質子化產物的洗脫帶減少（銳化），從而增加了其濃度以及與污染副產物的分離，圖 3。副產物也質子化，導致其比中性流動相更早洗脫。結果是大大改善了分離，產物以更集中的譜帶洗脫，并且與副產物的分離度更高。
圖 3. 使用酸化溶劑系統純化反應混合物，使產物峰尖銳并降低干擾副產物的保留。
然而，化學家在使用 pH 值修改的流動相時需要小心，因為潛在的化合物保留隨 pH 值變化而變化。在前面的例子中，電離化合物移動是有幫助的，但質子化化合物并不總是朝著有利的方向移動。當 pH 值發生變化時，洗脫的化合物可能會相互靠近甚至共洗脫。
我們可以看到這種情況發生在由靛紅酸酐和 α-甲基芐胺微波反應生成的合成產物 2-氨基-N-(1-苯乙基)苯甲酰胺中，圖 4。
圖 4. 靛紅酸酐與 α-甲基芐胺的微波反應
當使用中性水/甲醇梯度純化時，我們可以看到一些極性副產物在產品之前洗脫，以及強烈保留的副產物在產品后面以 9.5 至 14 CV 之間的寬峰形式洗脫，圖 6。
圖 6. 反應混合物的 pH 中性反相快速色譜
在兩種洗脫溶劑中添加 0.2% 冰醋酸后，洗脫化合物的保留率發生顯著變化。副產物在中性 pH 值下以 4 CV 洗脫，在酸性條件下離子化并以 1.5 CV 洗脫。尾隨的疏水性副產物也電離并移近產物，圖 7。
圖 7. 使用酸化水/甲醇梯度純化反應混合物，改變了兩種副產物的保留。
隨著產物和尾隨副產物之間分辨率的降低，該反應純化的負載能力降低，這意味著需要更大的柱（和更多的溶劑）來充分純化反應產物。
因此，雖然流動相 pH 值調整有助于改善純化，但請注意，洗脫體積和選擇性可能會發生變化，從而可能降低純化效率。
用于創建此數據的設備包括：
Biotage®引發劑+微波反應器
Biotage® Selekt Single 快速色譜系統
Biotage® Sphere C18 色譜柱，12 克
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