為了使用熒光標記物獲得最佳結(jié)果，必須考慮幾個因素。
首先，這是激發(fā)光源：為了減少樣品自發(fā)熒光可能產(chǎn)生的干擾，激發(fā)波長優(yōu)選在550 nm甚至600 nm以上。除了減少背景之外，紅色光譜范圍在處理活細胞時也具有優(yōu)勢，因為可以減少損傷。
其次，熒光標記應(yīng)在激發(fā)波長下具有強吸收以及高熒光量子產(chǎn)率。消光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率的乘積通常稱為染料的“亮度"。
染料的熒光效率在光譜的藍色和綠色區(qū)域最高。在某些情況下，量子產(chǎn)率幾乎達到100%的理論極限。對于更長的波長，發(fā)射的量子產(chǎn)率急劇下降，尤其是在水溶液中。然而， ATTO-TEC已成功開發(fā)出即使在 650 nm 下也具有高量子產(chǎn)率的熒光標記。例如，ATTO 647N在水溶液中發(fā)出的熒光強度是舊花青染料 Cy5 ™的兩倍。ATTO 647N和 Cy5 ™的相對熒光強度。PBS 水溶液1 cm 池中相應(yīng)吸收最大值處的吸光度為 0.04。22 °C 時兩個吸收光譜（相同吸收）交叉處的熒光激發(fā)。
最后，標記物的發(fā)射光譜應(yīng)與所用濾光片組的傳輸相匹配。反過來，必須選擇濾光片組，使其阻擋樣品散射的激發(fā)光并允許熒光盡可能有效地通過。
當使用波長為 635 nm 的二極管激光器作為激發(fā)源以及在 650 nm 至 750 nm 之間具有高透射率的濾光片組時，例如ATTO 647N將是一個非常好的選擇。從ATTO染料列表可以看出， ATTO647N635 nm處具有高消光系數(shù)，接近吸收曲線最大值的波長，以及優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率（η fl = 65%）。
下表概述了一些常用的激勵源和推薦的ATTO標簽。
| 光源 | 發(fā)射線 | 適用染料 |
|---|---|---|
| 水銀蒸氣燈 | 365納米 405納米 436 納米 546納米 577納米 | ATTO 390 ATTO 425、ATTO 430LS ATTO 425、ATTO 430LS、ATTO 465 ATTO 550、ATTO 565 ATTO Rho12、ATTO Rho101、ATTO 590 ATTO Rho13、ATTO 594、ATTO 610、ATTO Rho14 |
| 氬離子激光器 | 488nm 514nm | ATTO 488、ATTO 490LS ATTO 514、ATTO 520 ATTO 514、ATTO 490LS、ATTO 520 ATTO 532、ATTO 542 |
| Nd:YAG 激光器， 倍頻 | 532納米 | ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 542 ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho11、ATTO Rho12 |
| 氦氖激光器 | 633納米 | ATTO 643、ATTO 633、ATTO 647、 ATTO 647 N、ATTO 655 |
| 氪離子激光器 | 647nm 676nm | ATTO 643 ATTO 647、ATTO 647 N、ATTO 655、 ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680 ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740 |
| 二極管激光器 | 635納米 | ATTO 633、ATTO 643、ATTO 647、 ATTO 647 N、ATTO 655 |
熒光標記物的特性
然而，應(yīng)該注意的是，除了已經(jīng)討論的光學(xué)考慮因素之外，選擇標記時其他因素也很重要，例如染料的 pH 依賴性光學(xué)和化學(xué)特性、其溶解度、光和化學(xué)特性穩(wěn)定性、發(fā)色團的大小或連接體的長度等，其涉及或滿足各自應(yīng)用的要求。這些特性與染料作為熒光標記物的適用性非常相關(guān)。
最重要的是，染料在照射過程中保持完整。許多常見的標記，例如熒光素衍生物 FITC，具有非常低的光穩(wěn)定性。因此，當長時間觀察過程時，使用高強度激光激發(fā)時成像的靈敏度和質(zhì)量會受到限制。這對于顯微鏡和其他基于共焦原理的技術(shù)（例如單細胞的檢測）來說是一個嚴重的缺點。與一些常用的舊染料相比，新型ATTO標簽的設(shè)計即使在長時間暴露后也顯著更加穩(wěn)定。
ATTO 655與傳統(tǒng) Cy5的光穩(wěn)定性比較TM在水里。使用 250 W 鹵鎢燈照射，聚焦到 1 cm 池中。消光與照射持續(xù)時間。
許多常見的熒光標記物即使在沒有照射的情況下（即在黑暗中）也會分解，特別是當暴露于實驗室大氣中的低濃度臭氧時。在相同的臭氧暴露條件下，染料ATTO 647N和ATTO 655的穩(wěn)定性比花青染料 Cy5 TM和 Alexa647 TM長 100 倍。這在微陣列應(yīng)用中非常重要，因為染料分子位于表面，因此直接暴露在大氣中。
緊湊而強大的激光二極管現(xiàn)在覆蓋了光譜的整個可見光和近紅外部分。它們已作為非常有效的激發(fā)源進入許多應(yīng)用/設(shè)備，并越來越多地取代傳統(tǒng)光源。
如果沒有最大吸收與現(xiàn)有激發(fā)源的波長完*對應(yīng)的標記，則應(yīng)選擇波長稍長的染料。吸收會稍微降低，但激發(fā)波長和熒光光譜之間的較大差異（與激發(fā)波長無關(guān)）具有在檢測過程中更好地分離散射激發(fā)光的優(yōu)點。
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