來自S. pyogenes的Cas9核酸酶是依賴于RNA介導的內切核酸酶，可以特異地切割雙鏈DNA（在DNA PAM存在的情況下，也可以切割單鏈DNA或單鏈RNA）。Cas9切割位點位于目標序列（target sequence）內，離PAM（NGG）區3個堿基。PAM對于Cas9的識別和切割都是必需的。因為反應需要添加RNA（sgRNA或者crRNA:tracrRNA），整個體系，包括Cas9酶都必需不含任何核酸酶活性。其中，Cas9中的HNH和RuvC結構域分別負責切割靶標DNA中與sgRNA配對和非配對的鏈。本產品中，Cas9的H840被突變為A，使Cas9的HNH結構域失活。因此，Cas9（H840A）只有RuvC結構域有切割活性，是能夠形成單鏈缺刻的Nickase。

推薦反應體系（20 μL）：

組分                                           體積
10×TOLO Buffer 3                     2 μL
250 nM sgRNA                          2 μL
1 μM Cas9(H840A)                    1 μL
30 nM substrate DNA                2 μL
Nuclease-free water upto          20 μL
Incubate at 37 °C for 1 h, 85 °C 10 min