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小鼠胚胎成纖維細胞(3T3-L1)

細胞介紹

3T3-L1是從3T3細胞（Swissalbino）中經克隆分離得到的連續傳代的亞系。該細胞從快速分裂到匯合和接觸性抑制狀態經歷了前脂肪細胞到脂肪樣細胞的轉變。該細胞鼠痘病毒陰性；可產生甘油三酯，高濃度血清可增強細胞內脂肪堆積。

細胞特性：

1）  來源：小鼠胚胎

2）  形態：成纖維細胞，貼壁生長

3）  含量：>1x106  細胞數

4）  規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運輸和保存：干冰運輸及復蘇好存活細胞：（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理：

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的完培6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完培來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。     

一．培養基及培養凍存條件準備：

1） 準備DMEM培養基   86 %

小牛血清              10%                                               

GlutaMAX-1谷氨酰胺       1%

MEM NEAA非必需氨基酸    1%

Sodium Pyruvate丙酮酸鈉    1%                  P/S青霉素-鏈霉素       1%

2） 培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%

3） 凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。

注意事項：

1. 該細胞起始接種密度應在3000/平方厘米，并且在細胞達到80%融合或者密度介于5萬-6萬/平方厘米時傳代，避免細胞全融合。

2. 凍存復蘇后漂浮的細胞有可能是存活的，應通過溫和離心收集并繼續培養。

3. 3T3-L1這樣具有脂滴的細胞培養過程中受到壓力的表現出現空泡現象時正常的，原因可能是培養基中缺乏谷氨酰胺、添加了抗真菌劑、CO2濃度較低對培養基中碳酸氫鈉的影響或者使用的血清品質較低培養基的營養消耗殆盡。

4. 該細胞在DMEM(含1.5g/LNaHCO3)培養基中生長良好，大部分品牌的DMEM含有較高濃度的NaHCO3（3.7g/L），若使用DMEM（3.7g/L NaHCO3）培養基培養細胞時需要提高CO2濃度（7%-10%）。

二． 細胞處理：

1）凍存細胞的復蘇：：

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完培的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完培重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完培的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。

3. 輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完培以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。

注意事項：

1. 所有動物細胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級生物安全臺內操作，并請注意防護，所有廢液及接觸過此細胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。

2. 建議在復蘇凍存細胞時始終使用防護手套、衣服和戴上防護面罩。注意：凍存管浸沒在液氮中會泄漏，并會慢慢充滿液氮。解凍時，液氮轉化成氣相可能導致容器爆炸或用危險力吹掉其蓋子，從而產生飛揚的碎屑造成人員傷害。