熒光原位雜交技術fish檢測FFPE組織中miRNAs有很多優勢，可以使miRNAs在復雜組織中的確定位置形象化地體現，可以進行大量樣本的檢測
熒光原位雜交技術fish檢測的詳細介紹：
熒光原位雜交(FISH)技術檢測組織中的DNA或RNA序列，那他能不能檢測microRNAs呢？提到miRNAs，我們首先想到的是他們非常小，確實它們是很短的單鏈RNA分子，只有18-23個核苷酸。由于他們很小，所以對FISH技術的可行性有很多擔憂，比如探針能否具有足夠的敏感性和特異性，什么樣的探測系統適合于來自這些短的目標序列的信號等等。
miRNAs在FFPE組織中的完整性
很有趣的是，研究表明相比于mRNAs, miRNAs在福爾馬林固定的石蠟包埋組織(FFPE)中能夠更好地保存。正是因為他們的體積小, 可以和大的蛋白復合物緊密結合，使得它們能夠忍受這個過程。不過，需要一直保持沒有RNAse污染的環境，經常我們會使用DEPC水來準備溶液。當然，實驗需要的任何器具都需要提前進行高壓滅菌。
熒光原位雜交技術fish檢測抗原修復
經過福爾馬林固定交聯會限制探針和試劑，使它們不能接近目的miRNAs，可以用抗原修復術來暴露這些位點。大多數protocols會使用含有蛋白酶K的 tris緩沖液中來打破甲醛交聯，也有一些報告，蛋白酶K可能會破壞一些抗原表位，建議在檸檬酸緩沖中加熱樣本。這兩種方法都會有效, 可以探索哪種更適合自己的樣本。
熒光原位雜交技術fish檢測探針選擇
曾經有人探索使用標記的核酸探針進行miRNAs的FISH實驗，但由于目標序列太短，雙鏈穩定性差，而且與緊鄰的相關miRNAs有很高的序列相似性，使得很難達到足夠的特異性?，F在我們通常使用表現更好的Locked DNA(LNA)探針來實現這一過程。
Locked DNA是一類DNA類似物，糖環上被鎖定在一個亞甲基橋，使得探針在N構象穩定，因此LNA探針是結合的佳選擇， 它們在更高的溫度下實現更高的親和力和穩定性。*匹配的雙鏈和錯配之間所需溫度不同，所以更容易找到一個雜交溫度可以只檢測的*匹配,而且，LNA/miRNA雜交體可以抵抗核酸酶的攻擊。
對照探針
確保使用陽性和陰性對照探針,特別是設置程序時。陽性對照是檢測存在于特定組織中的miRNA，陰性對照設置兩個探針，其中一個含有兩處錯配，另一個是針對你所要檢測的組織中已知的不會表達的miRNA具有特異性。如果你難以區分背景噪音的信號,你應該還設置一個‘no probe’對照.
熒光原位雜交技術fish檢測雜交和洗滌
先在50°C進行兩個小時的預雜交，然后再與探針進行雜交過夜，溫度也是在50°C. 之后進行嚴格的洗滌步驟，這是去除非特異性反應的關鍵步驟。洗滌是在SSC緩沖液中，先是在37°C進行洗滌, 以去除多余的探針和雜交緩沖液，然后在50°C進行振蕩洗滌，以消除非特異性和重復性的雜交。如果非特異性結合仍然是一個問題,試著重復洗幾次。如果你剛剛開始實驗，可以探索下不同的雜交和洗滌溫度，可能上下兩度的的差異會帶來很大的不同。
熒光原位雜交技術fish檢測探針標記和信號檢測
市場上有很多種寡核苷酸標記示蹤劑以供選擇。生物素被用作5’端耦合，適合進行免疫組化檢測。如果你的組織是豐富的內源性生物素,dioxigenin應該是你的*選擇。結合anti-label抗體后,用辣根過氧化物酶系統將信號放大。還可以選擇一個合適的熒光基團為HRP底物，常使用的是花青染料, Alexa系列或Quasar染料也是一種選擇。根據所需的ex/em，雙標等選擇合適的標記。
熒光原位雜交技術fish檢測FFPE組織中miRNAs有很多優勢，可以使miRNAs在復雜組織中的確定位置形象化地體現，可以進行大量樣本的檢測。隨著科學發展，還可以同時檢測蛋白質標記的miRNA,以及多元miRNA FISH技術。無論在癌癥領域還是發育生物學領域，miRNA研究都是具有無限潛力的！
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