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熒光定量PCR（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。可用于mRNA、microRNA、lncRNA等基因表達(dá)量的檢測(cè)。

熒光定量Q-PCR原理：

熒光定量PCR常有兩種檢測(cè)方法

1）探針?lè)?/span>

PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開(kāi)始時(shí), 探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。

2）熒光定量Q-PCR檢測(cè)染料嵌入法

使用熒光染料SYBR或EVGreen。熒光染料可以結(jié)合到雙鏈DNA上面，當(dāng)體系中的模板被擴(kuò)增時(shí)，熒光染料可以有效結(jié)合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進(jìn)行，結(jié)合的熒光染料越來(lái)越多，被儀器檢測(cè)到的熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，從而達(dá)到定量的目的。

熒光定量Q-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法：

1）引物設(shè)計(jì)

2）RNA提取

3）RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

4）real time PCR 反應(yīng)

5）數(shù)據(jù)分析

熒光定量Q-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

基因表達(dá)量變化的直方圖、熱圖等

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