H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒

廣州創侖生物制品有限公司

 
【檢驗原理】
本試劑盒基于實時熒光PCR技術，分別選取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守區作為擴增靶區域，設計特異性引物探針，通過一步法實時熒光PCR體系擴增對H7N9禽流感病毒進行定性檢測。反應體系中除特異性引物和特異性熒光探針外，還配以對應的PCR反應Buffer、逆轉錄酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸單體（dNTPs）、Mg2+等成分，可實現對H7N9禽流感病毒核酸靈敏特異地檢測。
【主要組成成分】

H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒

【儲存條件及有效期】保存于-20±5℃，反復凍融次數＜5次，有效期9個月。

【適用儀器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等熒光定量PCR儀。

【樣本要求】
1 適用樣本類型：呼吸道樣本、血清、肺組織。
2 樣品采集、保存與運送。
標本采集、保存、運送請遵循《人感染H7N9禽流感病毒標本采集及實驗室檢測策略》。

【檢驗方法】
1.核酸提取
建議取200µl液態樣本進行核酸提取；組織樣本可以研磨液進行提取操作。可采用中山大學達安基因股份有限公司生產的核酸提取試劑盒，請按照試劑盒說明書進行操作；也可選擇其他合適的商業化產品。本試劑盒中的內標溶液參與提取過程，若提取試劑盒中未說明內標的使用方法可在每200µl樣本中加入4µl內標溶液后進行核酸提取。
本試劑盒中的陰性質控品參與提取，用于對環境進行監控；AIV H7N9陽性質控品不參與提取，用于PCR檢測試劑的質控。
2.PCR擴增（ABI 7500儀器操作為例，ABI 7300、LC480等儀器參照此操作及儀器操作手冊）
2.1分別配制AIV H7 RT-PCR反應體系和AIV N9 RT-PCR反應體系
2.1.1 AIV H7 RT-PCR反應體系配制
取適量PCR反應管（按AIV H7反應體系計算）；每管加入AIV H7 PCR反應液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應液B 3µl（也可按照單個反應的用量，計算PCR反應液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20µl于單個PCR反應管中）。
2.1.2 AIV N9 RT-PCR反應體系配制
取適量PCR反應管（按AIV N9反應體系計算）；每管加入AIV N9 PCR反應液A 17µl、AIV H7N9 PCR反應液B 3µl（也可按照單個反應的用量，計算PCR反應液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20µl于單個PCR反應管中）。
2.2 于上述PCR反應管中分別加入處理后的陰性質控品、AIV H7N9陽性質控品、待測標本核酸各5µl，8,000rpm離心數秒，放入PCR擴增儀。
2.3探針檢測模式設置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反應條件設置為：50℃ 15min，1個循環；95℃ 15分鐘，1個循環；94℃ 15秒→58℃ 45秒（收集熒光），45個循環。保存文件，運行。
3.結果分析
3.1 反應結束后保存檢測數據文件。 
3.2 分析條件設置：根據分析后圖像調節Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值（用戶可根據實際情況自行調整，Start值可以在3～15、End值可設在5～20，調整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊Analysis自動獲得分析結果，在Report界面察看結果。

【質量控制】
陰性質控品：FAM檢測通路擴增曲線無對數增長期，VIC檢測通路擴增曲線為明顯對數增長期；
陽性質控品：FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數增長期，且FAM檢測通道擴增曲線 Ct值≤32；
以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

【結果判定】
1.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應體系FAM檢測通道均無擴增曲線或Ct值＞40，且在VIC檢測通道均有對數增長期，可判樣品為H7N9禽流感病毒陰性；
2.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應體系擴增曲線在FAM,VIC檢測通道均有對數增長期且FAM檢測通道Ct值≤40；可判樣品為H7N9禽流感病毒陽性；
3.如果檢測樣品的AIV H7或N9 RT-PCR反應體系僅其中之一的擴增曲線滿足判為陽性的要求，則需重復檢測；若重復檢測結果為H7及N9均陽性，則判H7N9禽流感病毒陽性；若重復檢測結果仍為H7（或N9）陽性，則只能判禽流感病毒H7（或N9）亞型陽性，并建議以其他方法做進一步確認。

【檢測方法的局限性】
1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送及保存質量有關。
2.樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現假陽性結果。
3.病毒在流行過程中的基因突變則也可能導致假陰性結果。
4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取試劑進行樣本處理時核酸提取效率存在一定差異，本試劑盒推薦使用本公司生產的核酸提取試劑盒（離心柱法），用戶可根據具體要求進行選擇確認。
5.本檢測結果僅供臨床參考，如需確診病例請結合臨床癥狀及其他檢測手段.

【產品性能指標】
根據產品分析性能評估結果，本試劑盒的分析靈敏度為1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體（甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒H1亞型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亞型病毒、禽流感H9亞型病毒等）無交叉反應。

【注意事項】
1.實驗室管理應嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規范，實驗人員必須進行專業培訓，實驗過程嚴格分區進行（試劑準備區、標本制備區、擴增和產物分析區），所用消耗品應滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用的儀器和設備，各區各階段用品不能交叉使用；
2.為試劑和標本準備階段提供生物安全柜，實驗過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器；
3.試劑使用前要*解凍，8,000rpm離心數秒后使用；
4.標本制備區所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；
5.實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外線燈處理工作臺和移液器；
6.本試劑盒內陽性質控品應視為具有傳染性物質，操作和處理均需符合相關法規要求：衛生部《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》。