化工儀器網
技術文章
實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 實驗步驟
閱讀：986 發布時間：2024-9-29實時熒光定量 PCR (RT-qPCR) 是一種用于實時擴增和檢測特定 DNA 或 RNA 序列的分子生物學技術。該方法利用熒光染料或探針，當與擴增的 DNA 或 RNA 分子結合時會發出信號，從而可以對目標序列進行量化。RT-qPCR 通常用于基因表達分析、病毒載量定量和基因突變檢測等應用。
RT-qPCR原理的三個主要步驟：
1 反轉錄：
使用逆轉錄酶和特定引物將RNA樣品反轉錄成cDNA。
該步驟將RNA模板轉化為更穩定且可擴增的DNA形式。
反轉錄過程中使用特定引物。
2 PCR擴增：
使用特定引物對cDNA進行PCR擴增，這些引物環繞目標區域。
PCR是一個循環過程，呈指數級擴增DNA模板的數量。
PCR反應中包含熒光染料或探針，它們結合到擴增的DNA序列上并發出熒光信號。
3 熒光實時檢測：
使用實時PCR儀器實時監測熒光信號。
熒光的數量與每個PCR循環中擴增的DNA數量成比例。
使用專業軟件分析數據以確定循環閾值（Ct）值，該值表示熒光信號達到特定閾值水平所需的循環數。Ct值用于計算原始樣品中存在的目標DNA量，從而允許進行基因表達或病毒載量等定量分析。
實驗步驟：
1、RNA提取：RNA的提取是參照全式金生物的Transzol up提取試劑盒完成的。
A、離心機4℃預冷，準備試劑：氯仿、異內醇、75%乙醇（用DEPC水配制）、無RNase的水或DEPC水、無酶吸頭及試管，戴口罩、帽子、無粉乳膠手套；
B、取出轉染建模成功24h后的細胞，吸棄培養液，用1×PBS清洗1次；
C、每10cm2生長的細胞加入1mL的Transzol Up, 放置片刻后使用移液槍吹打細胞使其全脫落；
D、用移液槍反復吹吸裂解液直至無明顯沉淀，將裂解液全部轉移至標記好的1.5mL EP管中，室溫靜置5min；
E、往每個EP管中加0.2mL氯仿（Transzol Up體積的1/5），混勻振蕩30s，室溫靜置3min；
F、4℃條件下10000g離心15min，離心后RNA主要分布在上層水相中，體積約50%；
G、轉移上層水相于新的EP管中（約400μL，注意不要吸取到下層），每管加入0.5mL異丙醇 （Transzol Up體積的1/2），顛倒混勻，室溫孵育10min；
H、4℃下10000g離心10min后在管側和管底形成膠狀沉淀，吸棄上清，加1mL 75%乙醇吹懸沉淀；
I、4℃下7500g離心5min后棄上清，盡量吸凈，室溫晾干沉淀5min，依細胞量加入30~100μL的RNA溶解液；
K、55℃~60℃金屬浴10min，-80℃冰箱保存備用。
2、cDNA合成：見上文
3、qPCR：按表2.6，在ABI熒光定量PCR儀專用96孔板中建立qPCR反應體系，反應程序為兩步法（表2.11）
4、RT-qPCR統計：每個基因在不同組別中的表達在獲得3個重復的Ct值后，從ABI系統中拷貝原始數據，挑出“Ct SD"值大于0.5的組別（需重新實驗），求出各個組的管家基因GAPDH的均值（一般相差1個Ct值以內），再依次求出實驗組和對照組與各自的GAPDH之間的Ct差值，即得到第一個ΔCt，隨后求出實驗組ΔCt和對照組ΔCt的差值，即可得到第二個ΔCt（ΔΔCt），最后使用2 -ΔΔCt法求出實驗組相對于對照組的Ct值變化倍數（實驗組2 -ΔΔCt/對照組2 -ΔΔCt=實驗組2 -ΔΔCt/2 0=實驗組2 -ΔΔCt）。將3組實驗組數據導入Graphpad 9.0，輸入對照組數據為1，使用Student's t或ANOVA進行假設檢驗，p<0.05被認為有統計學差異。