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細胞周期檢測實驗具體操作說明
閱讀：648 發(fā)布時間：2024-5-27細胞周期是指細胞從一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段。如下圖：
G0期：這一期的細胞稱為休眠細胞，細胞暫時脫離分裂周期,不進行DNA復制和分裂。但這些細胞可在某些條件的誘導下可重新開始DNA合成, 進行細胞分裂。
G1 期：主要合成RNA、核糖體、蛋白質(zhì)、脂類和碳水化合物。
S期：這個時期主要合成DNA, 同時還會合成組蛋白, DNA復制所需的酶都在這一時期合成。
G2期：DNA合成后期。主要大量合成ATP、RNA、蛋白質(zhì), 包括微絲微管蛋白。
M期：RNA合成停止, 蛋白質(zhì)合成減少, 染色體高度螺旋化。
細胞周期檢測的原理：
PI法是經(jīng)典的周期檢測方法，PI是碘化丙啶(Propidium)，一種雙鏈DNA的熒光染料，碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可產(chǎn)生熒光，并且熒光強度和雙鏈DNA的含量成正比。細胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后，可以用流式細胞儀對細胞進行DNA含量測定，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可進行細胞周期和細胞凋亡分析。
通常正常細胞的G0/ G1 期具有二倍體細胞的DNA含量(2N)，G2/ M 期具有四倍體細胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于2N和4N之間。細胞用冰乙醇固定通透后，PI可以與細胞的DNA結(jié)合，其熒光強度直接反映了細胞內(nèi)DNA含量。
因此，可以通過流式細胞內(nèi)DNA含量進行檢測，將細胞周期區(qū)分為G1/G0 期，S 期和G2/M 期,并可得出各個時期細胞百分數(shù)。
細胞周期檢測實驗流程：
收集細胞：A: 收集細胞5~20×105于離心管中，若細胞比較小(如淋巴細胞)400 g離心，若細胞比較大(如腫瘤細胞)300 g離心，5~10 min，棄去培養(yǎng)液;
洗滌：加入1 ml冷PBS(提前放4℃預冷)洗滌1次，離心棄去上清;
固定前處理：利用管底殘留的液體，輕彈管底，將沉淀重懸成細胞懸液，避免細胞成團;
細胞固定：加入約1 ml -20℃預冷的無水乙醇中，輕輕吹打混勻，-20℃固定1 h或過夜;
洗滌：加入1 ml冷PBS(提前放4℃預冷)洗滌1次，300 g離心10min，棄去上清;
RNA酶消化：300 g 離心 5 min，吸盡上清后，加入 100 μL 的 RNase A 并充分懸浮細胞，37°C 水浴 30 min。
PI染色：加入400μL的PI溶液并充分混勻，4℃避光孵育30 min;
上機檢測：用流式細胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光，低速獲取細胞，采用分析軟件進行DNA含量分析。
細胞周期檢測注意事項：
1、培養(yǎng)細胞注意無菌環(huán)境。
2、染液等物質(zhì)有一定毒性，注意防護。
3、本實驗上機檢測所需收集細胞量較多，收集細胞時盡量多收集一些。
4、本實驗對細胞離心，重懸次數(shù)較多，注意動作輕緩，避免過多地損傷細胞。
5、固定時必須預冷PBS重懸打入無水乙醇中，二者順序不可顛倒。
6、培養(yǎng)細胞時，以對數(shù)期處理為宜，避免細胞量過少導致收集細胞量不足或者細胞量過多導致細胞開始大量死亡造成的實驗誤差。
7、固定后細胞雖然可以保存較長時間后再上機檢測，為避免不可控因素影響最好及早上機檢測。