化工儀器網
技術文章
實驗提取質粒DNA方法
閱讀：1706 發布時間：2019-12-27提取質粒DNA的方法有很多種，從提取產量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取，從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取，從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法、牙簽法等，各種不同的方法各有其優缺點，根據不同的實驗目的可以采用合適的提取方法。
堿裂解法:人們使用堿與SDS裂解法從E. coli(大腸桿菌)中分離制備質粒DNA已有30多年的歷史。將細菌懸浮液暴露于高pH值的強陰離子洗滌劑中，會使細胞壁破裂，染色體DNA和蛋白質變性，將質粒DNA釋放到上清中。盡管堿性溶劑使堿基配對*破壞，閉環的質粒DNA雙鏈仍不會彼此分離，這因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。只要OH-處理的強度和時間不要太過，當pH值恢復到中性時，DNA雙鏈就會再次形成。
質粒DNA煮沸法:是將細菌懸浮于含有Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶的緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細菌外壁，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質和染色體DNA變性。但是。閉環質粒DNA鏈彼此不會分離，這是因為它們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構。當溫度下降后，閉環DNA的堿基又各就各位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體DNA和蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。煮沸裂解法對于小于15kb的小質粒很有效，可用于提取步至lmL(小量制備)，多至250mL(大量制備)菌液的質粒，并且對大多數的大腸桿菌菌株都適用。
質粒小提試劑盒:用于大腸桿菌中質粒DNA的小量提取，它結合了優化的堿裂解法，以及方便快捷的硅膜離心技術，具有高效，快捷的特點，能在30min內完成全部操作。利用試劑盒能從1-5mL過夜培養的大腸桿菌菌液中純化得到10-40μg高質量的質粒DNA(OD260/OD280=1.7-1.9)，此質粒DNA可直接用于DNA序列分析，各種酶促反應，PCR以及部分細胞系的轉染等。