工作原理：

磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測原理
磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測用于測量在 Ser807/811 位點磷酸化的 Rb。與蛋白質印跡法不同，該檢測基于微孔板，不需要凝膠、電泳或轉膜。磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測使用兩種標記抗體，一種帶有供體熒光團，另一種帶有受體。第一種抗體因其對蛋白質上磷酸化基序的特異性結合而被選擇，第二種抗體因其能夠識別不依賴于其磷酸化狀態的蛋白質的能力而被選擇。蛋白質磷酸化使得涉及兩種標記抗體的免疫復合物形成，這使供體熒光團與受體緊密接近，從而產生熒光共振能量轉移（FRET）信號。其強度與樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度直接成正比，并在無需洗滌的檢測形式下提供了一種評估蛋白質磷酸化狀態的方法。

 磷酸化 Rb（Ser807/811）雙板檢測方案：

雙板方案涉及在 96 孔板中培養細胞，然后進行裂解，接著將裂解物轉移到低體積檢測板（HTRF 384-lv 或 96-lv 板）中，之后加入 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）檢測試劑。該方案能夠監測細胞的活力和融合度。 

磷酸化 Rb（Ser807/811）單板檢測方案：

使用 HTRF 試劑檢測磷酸化 Rb（Ser807/811）可以在一個用于培養、刺激和裂解的單板上進行。無需洗滌步驟。這個為高通量篩選設計的方案能夠實現微型化，同時保持強大的 HTRF 質量。 

 檢測驗證：

在 HCT-116 細胞中，CDK4/CDK6 抑制劑帕博西尼（Palbociclib）能有效抑制視網膜母細胞瘤蛋白在 Ser807/811 位點的磷酸化。

HCT-116 細胞以 50 微升的體積接種在 96 孔板中（每孔 50,000 個細胞），使用培養基并在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育。6 小時后，用不斷增加濃度的帕博西尼（另外添加 50 微升體積）處理細胞 19 小時。

移除培養基后，用 50 微升的補充裂解緩沖液在室溫下輕輕振蕩裂解細胞 30 分鐘，然后將 16 微升的裂解物轉移到低體積白色微孔板中，再加入 4 微升預混的 HTRF 磷酸化 Rb（Ser807/811）或總 Rb 檢測試劑。孵育 4 小時后記錄 HTRF 信號。

用Palbociclib（一種細胞周期蛋白依賴性激酶（Cdk4 和 Cdk6）抑制劑）處理會導致視網膜母細胞瘤蛋白在酸 807/811 位點的磷酸化顯著降低，同時該蛋白的總量也會減少（正如 Liu 等人在 2017 年發表于《Plos》的文獻中所報道的那樣）。

 在人和小鼠細胞系上對磷酸化 Rb 細胞檢測的驗證：

將 NIH 3T3、C2C12 和 HTC116 細胞以每孔 100,000 個細胞的密度接種在 96 孔板中。在 37°C、5% 二氧化碳的條件下孵育過夜后，移除細胞培養基，并向細胞中加入 50 微升裂解緩沖液。進行裂解步驟，輕輕振蕩 30 分鐘。將 16 微升樣品轉移到 384 孔小體積板中，然后加入三種 HTRF Rb 檢測試劑中的每一種各 4 微升。4 小時后記錄信號。

兩種 HTRF 磷酸化檢測方法都與小鼠模型兼容。

 使用人HCT116 細胞的磷酸化 Rb Ser807/811 細胞檢測，將 HTRF 檢測與蛋白質印跡法進行比較：

人類 HCT116 細胞在 T175 培養瓶中于 5% 二氧化碳、37°C 下培養。當細胞融合度達到 80% 時，裂解細胞并通過離心收集可溶性上清液。對細胞裂解物進行系列稀釋，將每種稀釋液的 16 微升轉移到 384 孔低體積白色微孔板中，最后加入磷酸化 Ser807/811 Rb 細胞檢測試劑盒試劑。并行比較顯示，HTRF 磷酸化檢測至少比蛋白質印跡法靈敏 27 倍。

簡化的通路：

細胞分裂周期中的視網膜母細胞瘤蛋白。

110kDa 的視網膜母細胞瘤蛋白 Rb 屬于口袋蛋白家族，該家族還包括 p107 和 p130。

Rb 起著腫瘤抑制因子的作用，調節細胞周期進程。

使該蛋白失活的突變會導致視網膜母細胞瘤癌癥的發展，在這種情況下，視網膜細胞無法被替換，并受到高水平的致突變紫外線輻射。

在沒有有絲分裂信號的情況下，具有活性的低磷酸化 Rb 結合并抑制 E2F 轉錄因子，而 E2F 轉錄因子是進入 S 期所必需的。

通過使 E2F 失活，Rb 將細胞維持在 G1 期，阻止細胞周期的進程。

在有絲分裂信號存在的情況下，Rb 被細胞周期蛋白 D-CDK4/6 和細胞周期蛋白 E-CDK2 依化并失活。這種磷酸化事件誘導 E2F 轉錄因子的釋放。

最后，E2F 激活諸如細胞周期蛋白、Cdk、胸苷激酶或 PCNA 等基因的轉錄，這些基因在 DNA 合成和復制以及細胞分裂中起著至關重要的作用。