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如何快速構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株？
如何在實驗流程上篩出高效表達(dá)的單克隆，
縮短篩選周期？
又將如何評估單克隆的穩(wěn)定性？
以 Gibco ExpiCHO 培養(yǎng)基系統(tǒng)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株為例，小編為大家簡述單克隆的篩選流程：
Gibco 培養(yǎng)基、補料、添加劑等，可用于常規(guī)哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)
1.準(zhǔn)備載體
通過內(nèi)切酶進(jìn)行載體線性化處理，利用核酸提取系統(tǒng)和純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒DNA提純。
賽默飛 KingFisher Flex 基于磁珠分離的高通量核酸提取設(shè)備
2.轉(zhuǎn)染細(xì)胞
轉(zhuǎn)染前利用細(xì)胞計數(shù)儀確保細(xì)胞密度控制在2*106-6*106cells/mL，細(xì)胞活力在95–99%之間。
將ExpiFectamine CHO轉(zhuǎn)染系統(tǒng)與質(zhì)粒DNA室溫孵育1-5min后轉(zhuǎn)移到搖瓶培養(yǎng)系統(tǒng)。37℃ 8% CO2孵育兩天后測定細(xì)胞活力，細(xì)胞個數(shù)以及抗體滴度 (理想情況高于4 mg/L)。
Nalgene一次性PETG無菌搖瓶
3.篩選
以5*105cells/mL的細(xì)胞密度，在30 mL ExpiCHO表達(dá)培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。搖瓶中加入G418或Puromycin等相應(yīng)選擇壓力。培養(yǎng)第7天進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，每3-5天傳代一次。細(xì)胞密度達(dá)到1*106 viable cells/mL，細(xì)胞活力超過85%時，階段一結(jié)束，并進(jìn)行細(xì)胞凍存。從階段一獲取的細(xì)胞，將選擇壓力調(diào)整為階段一的2-5倍進(jìn)行再次篩選。
4.混合細(xì)胞株生產(chǎn)力的評估
從階段二獲取的細(xì)胞，以5*105cells/mL的細(xì)胞密度，在125mL搖瓶中培養(yǎng)。分別在第0，3，5，7，10，12和14天 (建議把第零天放到周五) 取樣檢測細(xì)胞密度，活力和抗體滴度。
5.獲取單克隆
將混合細(xì)胞株按照如下稀釋比例稀釋至1000 cells/mL，利用分液器以0.5 cell/孔的密度接種至96孔板中，靜置培養(yǎng)。
混合細(xì)胞株的層級稀釋比例
賽默飛Combi nL自動分液器
分液體積50納升至50微升
6.單克隆的放大培養(yǎng)以及篩選評估
將篩選出的單克隆從96孔板依次放大至125 mL搖瓶中培養(yǎng)。并進(jìn)行層級篩選。
初始篩選：6孔板培養(yǎng)5天后，評估細(xì)胞蛋白表達(dá)，從中選取表達(dá)量較高的15-40個克隆轉(zhuǎn)移至125 mL 搖瓶中；并進(jìn)行細(xì)胞液氮凍存。
二級篩選：14天簡單補料添加評估，分別在0，3，5，7，10，12和14天取樣檢測細(xì)胞密度，活力和抗體滴度；并在第3，5，7天補加葡萄糖培養(yǎng)。并進(jìn)行細(xì)胞液氮凍存。
三級篩選：14天補料添加評估，細(xì)胞復(fù)蘇傳代2-5次后，3-14天檢測細(xì)胞培養(yǎng)密度、活力以及蛋白表達(dá)。每個克隆均需要有1-3個平行對照。
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度純度和糖譜分析，單樣品分析耗時可小于40s
7.細(xì)胞株穩(wěn)定性的評估
接下來需要評估獲取的單克隆可以在多長的周期穩(wěn)定表達(dá)蛋白。挑選16個單克隆，在搖瓶中傳代60次或者連續(xù)培養(yǎng)12周評估單克隆的穩(wěn)定性。
