單克隆分離技術主要包括有限稀釋法、克隆環法和顯微操作法。有限稀釋法是通過將細胞懸液連續梯度稀釋，使最終在細胞培養板的一個孔中僅有1個細胞，再經過兩周左右時間增殖，形成細胞群，再經過驗證獲得穩定克隆；克隆環法是通過在10-15cm的細胞培養皿中，將細胞接種低密度,使分散的單個細胞各自增殖成細胞群，用克隆環方式與周圍的細胞隔離開，通過胰酶消化，轉到新的孔板中繼續培養擴增，并檢測驗證而獲得穩定克??；顯微操作法是借助顯微鏡，在放大的視野下挑取單細胞，再轉至培養孔中，逐漸擴增獲得單克隆。
這三種方法有各自一定的局限性：有限稀釋法對懸浮細胞較為合適，但是實際中貼壁細胞的需求占絕大多少，而且很多細胞在極低密度下生長極慢甚至不能生長，無法進行單細胞克??；克隆環法不僅需要購買克隆環，而且因為細胞數量較少時肉眼難辨，必須等到細胞數量擴增到幾百時才能進行分離，因此需要等待較長時間，而且操作步驟多、難度大，實驗人員通常需要有豐富經驗；顯微操作法需要借助昂貴的特殊顯微鏡或將常規顯微鏡搬至安全柜內使用，操作難度加大，而且易造成細胞污染而前功盡棄。
單克隆分離方法：
a、在培養皿中制備飼養細胞（小鼠腹腔細胞）單層。
b、臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養液混勻，配成1%瓊脂糖培養液，45℃水浴中溫育。
c、吸去平皿上層培養液，加入1%瓊脂糖培養液3ml，室溫10分鐘。
d、取雜交瘤細胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養液1ml混勻，鋪于上層。
e、37℃、7.5%濕潤培養7-14天；克隆生長至2mm時，用毛細吸管吸出克隆，直接轉種于含有飼養細胞的24孔板，擴大培養。
f、吸取上清，檢測抗體，陽性孔可繼續克隆化，或擴大培養、凍存。
