單細胞分離是研究中困難的步驟之一，目前的分離策略主要分為三類：手動分離、熒光激活的細胞分選和微流體技術。
在進行單細胞轉錄分析之前，我們需要確定自己拿到了正確的細胞。如果你想要的細胞已經處于懸浮狀態（比如循環腫瘤細胞），而且含量相對比較豐富，那么流式細胞分析將是你的理想選擇。如果樣本是實體組織，我們可以用酶分解掉膠原和其他細胞外蛋白。不過酶學消化對細胞影響較大，甚至可能改變基因轉錄情況。
把組織細胞制成懸液之后，我們就可以通過特異性的熒光標簽分離出自己想要的細胞，進一步拿到單細胞是比較棘手的一步，可能需要用到微流體設備。
單細胞分離法是一種從待分離的材料中直接分離單個細胞進行培養獲得純培養的方法。該法在顯微鏡下操作，對于體積較大的微生物，可以用毛細管提取微生物個體；對較小的細胞或孢子，可以用顯微針、鉤、環等挑取以獲得單細胞；也可將適當稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含有一個細胞的液滴培養。
對于個體相對較小的微生物，需采用顯微操作儀，在顯微鏡下進行。目前，市場上有售的顯微操作儀種類很多，一般是通過機械、空氣或油壓傳動裝置來減小手的動作幅度，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養。
在沒有顯微操作儀時，也可采用一些變通的方法在顯微鏡下進行細胞分離，例如，將經適當稀釋后的樣品制備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含一個細胞的液滴進行培養以獲得純培養。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限于高度專業化的科學研究中采用。
