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簡述熒光探針法PCR檢測試劑盒的應用
閱讀：409 發(fā)布時間：2023-2-10熒光定量PCR檢測試劑盒的原理在于PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；剛開始時, 探針結合在DNA任意一條單鏈上;PCR擴增時，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成wan全同步。或者使用熒光染料SYBR。SYBR可以結合到雙鏈DNA上面，當體系中的模板被擴增時，SYBR可以有效結合到新合成的雙鏈上面，隨著PCR的進行，結合的SYBR染料越來越多，被儀器檢測到的熒光信號越來越強，從而達到定量的目的。接下來小編簡單為大家介紹一下熒光探針法的相關信息。
zui常用于熒光免疫法中標記抗原或抗體，亦可用于微環(huán)境，如表面活性劑膠束、雙分子膜、蛋白質(zhì)活性位點等處微觀特性的探測。通常要求探針的摩爾吸光系數(shù)大，熒光量子產(chǎn)率高；熒光發(fā)射波長處于長波且有較大的斯托克斯位移；用于免疫分析時，與抗原或抗體的結合不應影響它們的活性。
目前常用的熒光探針有熒光素類探針、無機離子熒光探針、熒光量子點、分子信標等。熒光探針除應用于核酸和蛋白質(zhì)的定量分析外，在核酸染色、DNA電泳、核酸分子雜交、定量PCR技術以及DNA測序上都有著廣泛的應用。
目前，檢測熒光探針的方法主要有單點測定和電荷耦合裝置（CCD）熒光成像（包括用于微區(qū)分析的激光共聚焦熒光顯微鏡成像）。由于光電倍增管點掃描時間較長，激光照射強度高，很難抓住熒光早期變化。而CCD熒光成像的面陣大，成像視野廣，成像時間可以調(diào)節(jié)，因而檢測效果比較好。
化學發(fā)光檢測的zui大特點是設備簡單、操作簡便、分析速度快及靈敏度高。化學發(fā)光成像分析(CLI)是將化學發(fā)光與成像技術相結合，從而具有分辨率高、多樣品同時檢測、光譜響應范圍寬以及靈敏度高等特點[10,11]，已廣泛應用于凝膠、蛋白印記及微陣列芯片中的化學發(fā)光信號檢測。本實驗建立了TCPO?咪唑?H2O2?熒光探針化學發(fā)光成像體系。由于化學發(fā)光不需要任何光源，因而在對熒光探針進行化學發(fā)光成像檢測時，不存在熒光檢測或者熒光成像時不可避免的光學背景的干擾，從而可以獲得更低的檢出限。用此體系對5種熒光探針進行定量分析，并研究了用四甲基異硫氰酸羅丹明（TRITC）標記的單克隆羊抗人IgG的化學發(fā)光成像，檢出限達10－11mol/L，比相同條件下熒光成像的檢出限低一個數(shù)量級。