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從臍血來源多能祖細胞（CB-MNCs）中分離并培養CD34+細胞實驗
閱讀：586 發布時間：2019-2-28實驗方法原理
實驗材料 CB-MNCs
試劑、試劑盒 滅菌培養基過柱緩沖液FcR阻斷劑CD34微球
儀器、耗材 柱子（MS+ RS+或LS+ VS+)磁珠細胞分離儀尼龍過濾網 30μm
實驗步驟
(a)準備過柱緩沖液，用抽真空裝置去除氣體。
(b)每108個CB-MNCs用終體積300μL緩沖液重懸。
(c)每108個CB-MNCs懸液加100μL FcR阻斷劑，抑制CD34微珠非特異性結合或通過Fc受體介導與非靶細胞的結合。
(d)每108個CB-MNCs懸液加100μL CD34微球進行細胞標記，充分混勻后在6?12℃冰箱放置30min。
(e)加PBSA洗，室溫200g離心10min;加適量的緩沖液重選細胞。
(f)根據CB-MNCs的細胞總數選擇合適的柱子類型（MS+/RS+或LS+/VS+)，將柱子放人MACs分離儀的磁場中。加人緩沖液潤洗柱子（MS+/RS+:50μL;LS+/VS：3mL)。
(g)用30μm的尼龍過濾網過濾細胞，去除細胞團。使用前，用緩沖液濕潤柱子。
(h)將細胞懸液加人柱子，使未結合的細胞通過柱子。
(i)用緩沖液將未結合的細胞洗去（MS+/RS+:3×500μL;LS+/VS:3×3mL)。
(j)洗脫結合的細胞。將柱子從分離儀中移出。置于合適的管中。將柱子加滿緩沖液（MS+/RS+:1mL;LS+/VS: 5mL)。用柱子隨帶的內塞，加壓將結合的細胞沖洗出來。
(k)加PBSA將CD34+細胞洗一遍，室溫200g離心l0min。用適當的培養基重懸細胞。
體外擴增CD34+細胞
實驗方法原理 ，
實驗材料 CD34+細胞
試劑、試劑盒 ?滅菌培養基；*IMDM細胞因子（Flt-3配體干細胞因子促血小板生成素IL-6)
儀器、耗材 培養瓶
實驗步驟
(a)用添加細胞因子的培養基重懸細胞（50 ng/mL Flt-3配體，50 ng/mL干細胞因子，20 ng/mL促血小板生成素和10 ng/mL IL-6)。
(b)按2×104個細胞/mL的細胞濃度將CD34+細胞接種到T25培養瓶中。
(C)每周兩次半量換液，補充細胞因子。
飼養層細胞共培養體外擴增CD34+細胞
驗方法原理
實驗材料 CD34+細胞
試劑、試劑盒 ?滅菌MSCs培養基C100μg mL共培養的培養基細胞因子（干細胞因子IL-6Flt-3配體促血小板生成素）
儀器、耗材 6孔培養板
實驗步驟
(a)將臍帶血來源的間充質干細胞（blood-derived mesenchymal stem cells, CB-MSCs)作為飼養層細胞，用MSCs培養基重懸CB-MSCs，細胞濃度為5×104個細胞/mL。
(b)將CB-MSCs接種到6孔板
(C)每周兩次半量更換新鮮培養基。
(d)當CB-MSCs達到以上匯合時，用10μg/mLc處理,37℃ 2.5 h„
(e)用無血清IMDM將CB-MSCs洗兩遍。
(f)按1×104個/mL CD34+細胞重懸于含細胞因子的共同培養基（100 ng/mL干細胞因子，100ng/mL IL-6,50 ng/mLFlt-3配體，10 ng/mL促血小板生成素）。
(g)將CD34+細胞接種到CB-MSCs飼養層細胞上。
(h)每周兩次更換1/4培養基。
(i)2周后，收集未貼壁細胞