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豬鏈球菌 2 型三重 PCR 檢測方法
閱讀：473 發布時間：2021-1-4GB/T 19915.4—2005
豬鏈球菌 2 型三重 PCR 檢測方法
1 范圍
本標準規定了豬鏈球菌2型莢膜基因（cps2）、溶菌酶釋放蛋白基因（mrp）和 orf2這三個毒力基因的三重 PCR 檢測技術。
本標準適用于由豬鏈球菌 2 型致病基因和致病菌株的檢測。 2 規范性引用文件
下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的 。新版本。凡是不注日期的引用文件，其。新版本適用于本標準
GB/T 6682—1992 分析實驗室用水規格和試驗方法 3 術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。 3.1
豬鏈球菌 2 型 Streptococcus suis type 2
豬鏈球菌是屬于鏈球菌屬的一種細菌，根據其莢膜多糖抗原的差異，可分為1～34 及1/2共 35個血清型。豬鏈球菌2型是豬鏈球菌的一個血清型，不僅對豬致病性很強，而且可以感染特定的人群，是一種重要的人畜共患病病原菌。 4 測定方法
4. 1 方法提要
挑取可疑細菌培養物菌落，加入PCR反應管中，進行 PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產物，與標準分子量標記比較，來確定擴增產物的大小。 4.2 試劑和材料
除另有規定，所用試劑均為分析純，水為符合 GB/T 6682—1992的滅菌雙蒸水。 4.2.1 cps2、mrp和orf2 的上下游引物，按合成說明書使用。 4.2.2 Tag DNA 聚合酶。 4.2. 3 瓊脂糖∶電泳級。 4.2.4 溴化乙錠。
4.2.5 分子量標記∶DL-2000。
4.2.6 TE緩沖液∶10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH 8.0）。
4.2.7 10×PCR緩沖液∶100 mmol/LKCl，160 mmol/L（NH，）2SO，20mmol/L MgSO，，200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.8),1% TritonX-100,1 mg/mL BSA。
4.2.8 電泳緩沖液∶242gTris堿，57.1mL冰乙酸，100 mL0.5 mol/L EDTA（pH8.0），加蒸餾水至 l O00 mL，使用時 10 倍稀釋。
4.2.9 加樣緩沖液∶0.25%溴酚藍，40%蔗糖。
4.2.10 陽性對照豬鏈球菌2型 HA9801 株基因組 DNA 模板，陰性對照馬鏈球菌獸疫亞種 ATCC 35246 株和金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 株基因組 DNA 模板。
4.2.11 豬鏈球菌2型三重 PCR反應混合物。 4.3 儀器和設備 4.3.1 離心機。 4.3.2 DNA熱循環儀。 4.3.3 核酸電泳儀。 4.3.4 pH計，
4.3.5 移液器∶10μL、20μL、100μL、1 000μL。 4.3.6 紫外線透射儀或凝膠成像系統。 4.3.7 恒溫水浴鍋。 4.4 PCR 操作步驟
4.4.1 陽性對照和陰性對照 DNA 模板的提取
分別將豬鏈球菌 2 型 HA9801、馬鏈球菌獸疫亞種 ATCC 35246株和金黃色葡萄球菌 ATCC 25923 株接種于5%犢牛血清 Todd-Hweitt 肉湯培養基，37℃搖振培養18h，用革蘭氏陽性細菌柱離心式基因組 DNA 小量抽提試劑盒提取 DNA 模板，—20℃保存備用。 4.4.2 PCR 擴增
用鉑金耳釣取血平板上的可疑單菌落至含有豬鏈球菌2型三重 PCR反應混合物的 PCR管中，混勻，加入 Taq 酶（2 U/μL）0.7μL，2000 r/min離心10 s，立即進行 PCR擴增;同時設去離子水的空白對照、豬鏈球菌2型 HA9801株基因組 DNA 模板的陽性對照、馬鏈球菌獸疫亞種ATCC35246 和金黃色葡萄球菌 ATCC 25923株基因組 DNA模板的陰性對照。擴增條件為∶94℃預變性5min;94℃30s， 55℃30 s，72℃40 s，30 個循環;72℃延伸7 min，4℃保存。 4. 4.3 瓊脂糖凝膠電泳
在電泳緩沖液中加入1%瓊脂糖，加熱融化后加入溴化乙錠制備凝膠，凝固后進行電泳。8μL酶切產物加入2 μL5×上樣緩沖液，混勻后加入上樣孔，80 V 恒壓電泳 20 min，紫外線透射檢測。 5 結果及判斷 5.1 試驗結果成立條件
陽性對照 HA9801 株經 PCR擴增出現約 858 bp、387 bp和 316 bp三條條帶，去離子水的空白對照、馬鏈球菌獸疫亞種 ATCC 35246 和金黃色葡萄球菌ATCC 25923 株基因組 DNA模板的陰性對照 PCR 產物電泳后沒有條帶，試驗結果成立，否則，結果不成立。 5.2 結果判斷
瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外線投射下檢測，在空白和陰、陽性對照成立的情況下，待檢樣品只出現 387bp一條條帶，可判定為豬鏈球菌2型;待檢樣品出現約387bp、316bp和858bp三條條帶，或出現 387bp和858bp兩條條帶，可判定為豬鏈球菌2型致病菌株;待檢樣品只出現858bp一條條帶，可判定為非豬鏈球菌 2 型的致病菌;待檢樣品不出現條帶，結果為陰性。 6 廢棄物處理和防止污染的措施
檢測過程中的廢棄物，應收集后高壓滅菌處理。
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