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分子生物學實驗基礎知識
閱讀：332 發布時間：2020-12-18分子生物學是在生物化學基礎上發展起來的，以研究核酸和蛋白質結構、功能等生命本質的學科，在核酸、蛋白質分子水平研究發病、診斷、治療和預后的機制。其中基因工程（基因技術，基因重組）是目前分子生物學研究熱點，這些技術可以改造或擴增基因和基因產物，使微量的研究對象達到分析水平，是研究基因調控和表達的方法，也是分子水平研究疾病發生機制、基因診斷和基因治療的方法。轉化（transformation）、轉染、轉導、轉位等是自然界基因重組存在的方式，也是人工基因重組常采用的手段。基因重組的目的之一是基因克隆（gene clone），基因克隆可理解為以一分子基因為模板擴增得到的與模板分子結構*相同的基因。使需要分析研究的微量、混雜的目的基因易于純化，得以增量，便于分析。
外來基因引起細胞生物性狀改變的過程叫轉化（transformation），以噬菌體把外源基因導入細菌的過程叫轉染（transfection）。利用載體（噬菌體或病毒）把遺傳物質從一種宿主傳給另一種宿主的過程叫轉導（transduction）。一個或一組基因從一處轉移到基因組另一處的過程叫轉位（transposition），這些游動的基因叫轉位子。
一、基因工程的常用工具
（一）載體
載體（Vector）是把外源DNA（目的基因）導入宿主細胞，使之傳代、擴增、表達的工具。載體有質粒（plasmid）、噬菌體、單鏈絲狀噬菌體和粘性末端質粒（粘粒）、病毒等。載體具有能自我復制；有可選擇的，便于篩選、鑒定的遺傳標記；有供外源DNA插入的位點；本身體積小等特征。
質粒存在于多種細菌，是染色體（核）以外的獨立遺傳因子，由雙鏈環狀DNA組成，幾乎*裸露，很少有蛋白質結合。質粒有嚴緊型和松弛型之分。嚴緊型由DNA多聚酶Ⅲ復制，一個細胞可復制1-5個質粒。而松弛型由DNA多聚酶Ⅰ復制，一個細胞可復制30-50個質粒，如果用氯霉素可阻止蛋白質合成，使質粒有效利用原料，復制更多的質粒。質粒經過改造品種繁多，常用的有pBR322、pUC系列等。這些質粒都含有多個基本基因，如復制起動區（復制原點Ori），便于復制擴增；抗抗生素標記（抗氨芐青霉素Apr、抗四環素Tcr等）或大腸埃希菌部分乳糖操縱子（E.coli LacZ）等，便于基因重組體的篩選；基因發動子（乳糖操縱子Lac、色氨酸操縱子Trp等）和轉錄終止序列，便于插入的外源基因轉錄、翻譯表達。質粒上還有許多限制性內切酶的切點，即基因插入位點，又叫基因重組位點，基因克隆位點。
常用噬菌體載體有單鏈噬菌體M13系統；雙鏈噬菌體系統。噬菌體應和相應的宿主細胞配合使用。以上載體各有特點，便于選擇，靈活應用。
（二）工具酶
工具酶是基因重組技術*的工具。主要有限制性內切酶、連接酶、核酸聚合酶、逆轉錄酶、核酸酶等。
限制性內切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內切酶之分，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，并在識別區內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內切酶。識別分四核苷酸和六核苷酸，其序列旋轉對稱。切口分開端和粘端，產生3′－OH和5′－P末端。內切酶品種多，使用時應注意溫度、緩沖液用量（一般1μg DNA/2-5單位酶）等反應條件。