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SDS-PAGE電泳的基礎原理和實驗步驟
閱讀：5794 發布時間：2020-12-4概述
十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE）是聚丙烯酰胺凝膠電泳中。常用的一種蛋白表達</a>分析技術。此項技術的原理，是根據檢體中蛋白質分子量大小的不同，使其在電泳膠中分離。在大腸桿菌表達純化外源蛋白的實驗中，SDS-PAGE更是*的操作，其通常用于檢測蛋白的表達情況（表達量，表達分布），以及分析目的蛋白的純度等。
SDS-PAGE作用機理
蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表現出不同的電荷，為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關，我們在上樣前，通常會進行一些處理(上樣緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS 和β-巰基乙醇的上緩沖液。SDS 即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一種陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構； β-巰基乙醇是強還原劑，它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。電泳樣品加入樣品處理液后，經過高溫處理，其目的是將SDS 與蛋白質充分結合，以使蛋白質*變性和解聚，并形成棒狀結構同時使整個蛋白帶上負電荷；另外樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料，用于監控整個電泳過程；另外樣品處理液中還加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。當樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽的上方為負極，下方為正極)，在凝膠中形成移動界面并帶動凝膠中所含SDS負電荷的多肽復合物向正極推進。樣品首先通過高度多孔性的濃縮膠，使樣品中所含SDS 多肽復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區帶（或稱積層）。
電泳啟動時，蛋白樣品處于pH6.8 的上層，pH8.8 的分離膠層在下層，上槽為負極，下槽為正極。出現了 pH 不連續和膠孔徑大小不連續：啟動時Cl¯解離度大，Pro¯解離度居中，甘 aaCOO¯解離度小，遷移順序為（pH6.8）Cl¯> Pro¯ >—COO¯。在 Cl¯與 Pro¯之間和 Pro¯與—COO¯之間都將出現低離子區，同時也出現高電勢，高電勢迫使 Pro¯向 Cl¯遷移，—COO¯向 Pro¯遷移。如：一個 Cl¯領路，—COO¯推動，蛋白在中間，這樣就起到濃縮的作用了。在濃縮膠運動中，由于膠聯度小，孔徑大，Pro¯受阻小，因此不同的蛋白質就濃縮到分離膠之上成層，起濃縮效應，使全部蛋白質處于同一起跑線上。當蛋白質進入分離膠時，此時Pro¯，Cl¯，甘 aa 離子在 pH8.8 的溶液中，Cl¯*電離而很快到達正極，甘 aa 電離度加大很快躍過蛋白質，而到達正極，只有蛋白質分子在分離膠中較為緩慢的移動。由于 Pro¯在電泳過程中，受到溶液離子的變化而 pH 值發生變化，但每一瞬間，其所帶電荷數除以單位質量是不同的，所以帶負電荷多者遷移快，反之則慢，這就現了電荷效應。由于膠孔徑小，而且成為一個整體的篩狀結構，它們對大分子阻力大，小分子阻力小，起著分子篩效應，也就是蛋白質在分離膠中，以分子篩效應和電荷效應而出現遷移率的差異，終達到彼此分開。
PAGE 膠的聚合原理：甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過硫酸胺的作用下聚合，形成膠，如下圖：
注：催化劑：過硫酸銨（AP）在隔氧的狀態下，。好現配現用，使用新鮮的。
加速催化劑：TEMED，四甲基乙二胺。催化劑的作用是使單體聚合成網狀聚合物。
SDS聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍：
丙烯酰胺濃度（%） | 線性分離范圍（KD） |
15 | 10-43 |
12 | 12-60 |
10 | 20-80 |
7.5 | 36-94 |
5.0 | 57-212 |
試劑及主要器材
通常在SDS-PAGE電泳實驗中用到以下幾種試劑：
1、主要試劑
30％凝膠貯備液：丙烯酰胺（Acr）29.2g，亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）0.8g，加雙蒸水至100mL。外包錫紙，4℃冰箱保存，30天內使用。
分離膠緩沖液(1.5mol／L): Tris 18.17g，加雙蒸水溶解，6mol/L HCl調pH8.8，定容100mL。4℃冰箱保存
濃縮膠緩沖液(0.5mol／L): Tris 6.06g，加水溶解，6mol/L HCl調8，并定容到100mL。4℃冰箱保存
電極緩沖液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加雙蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。
10％SDS，室溫保存
質量濃度10％過硫酸銨(新鮮配制)
上樣緩沖液：5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，β-巰基乙醇1mL，0.1％溴酚藍0.5mL，加蒸餾水定溶至10mL。
考馬斯亮藍R-250染色液（1L）：1g考馬斯亮藍R250，加入450甲醇，100ml冰醋酸
脫色液（1L）：100ml甲醇，100ml冰醋酸
未知分子量的蛋白質樣品(1mg／mL )
2、實驗器材
垂直板電泳槽
電泳儀
長滴管及微量加樣器
燒杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培養皿(375px´l125px)
槍頭（1ml、200ul、10ul）
注射器等
SDS-PAGE所需溶液：
A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉雙丙稀酰胺0.8g，加入去離子水定容至100mL，pH值不能超過7.0，過濾于棕色玻璃瓶中4℃貯存。
B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs堿，溶于60mL（30mL）去離子水中，加入約3mL(1.5mL)以上的濃鹽酸調節pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。
C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs堿，溶于60mL（30mL）去離子水中，加入約7mL(3.5mL)以上的濃鹽酸調節pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。
D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去離子水中，定容至100mL(20mL)，加熱至68℃助溶。
E液——10％過硫酸銨：5g(0.5g)過硫酸銨，溶于50mL(5mL)去離子水中；現配現用或分裝至0.5mL離心管中冷凍備用。
F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，低溫保存。
聚丙烯酰胺（Acrylamide）的作用：丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體，其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否，與促凝劑及環境密切相關。
制膠緩沖液：濃縮膠選擇pH6.7，分離膠選擇pH8.9，選擇TRIS-HCL系統。
TEMED與AP：AP提供自由基，TEMED是催化劑，催化自由基引起的聚合反應進行。
十二烷基硫酸鈉（SDS）：陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。
注意： 丙烯酰胺具有很強的 神經毒性 并可以通過皮膚吸收，其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺（N,N’-Methylenebisacrylamide）時應戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒，但也應謹慎操作，因為它還可能會含有少量未聚合材料。
SDS-PAGE實驗標準操作流程
1. 清洗玻璃板
一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉 輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
2. 灌膠與上樣
玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）
配 12％分離膠，加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用 3ml的吸管或10ml 槍吸取適量的膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）
分離膠和濃縮膠的制備：按下表中溶液的順序及比例，配置12％的分離膠和5.1％的濃縮膠。
試劑名稱 | 12%的分離膠（8塊，35ml） | 5.1%的濃縮膠（8塊，12ml） |
30%凝膠貯備液/ml | 14 | 2 |
分離膠緩液（pH 8.8）/ml | 8.75 |
|
濃縮膠緩沖液（pH 6.8）/ml |
| 3 |
雙蒸水/ml | 12.25 | 6.9 |
10%過硫酸銨/ul | 175 | 100 |
TEMED/ul | 15 | 10 |
注：分離膠與濃縮膠的濃度計算公式：
A%*Va/V總 =C ，A%為30％凝膠貯備液，
例如，12%的分離膠：0.3*10/25=12%
1.當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
2.按前面方法配 5.1％的濃縮膠,加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
3.用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）
4.測完蛋白含量后，計算含 50μg 蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至 0.5ml 離心管中，加入 5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為 1×。（上樣總體積一般不超過 15μl，加樣孔的大限度可加 20μl 樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮 5min 使蛋白變性。
5.加足夠的電泳液后開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3 次，以免交叉污染。
3. 電泳
加樣完畢，蓋好上蓋，連接電泳儀，打開電泳儀開關后，樣品進膠前電壓控制在100～200V，大約15～20min；樣品中的溴酚藍指示劑到達分離膠之后，電壓升到200V，電泳過程保持電壓穩定。當溴酚藍指示劑遷移到距前沿1～50px處即停止電泳，約0.5-1小時。如室溫高，打開電泳槽循環水，降低電泳溫度。
電泳。
4. 染色、脫色
電泳結束后，關掉電源，取出玻璃板，在長短兩塊玻璃板下角空隙內，用刀輕 輕撬動，即將膠面與一塊玻璃板分開，然后輕輕將膠片托起，指示劑區帶中心插入銅絲作為標志，放入大培養皿中染色，使用0.25％的考馬斯亮藍染液，染色2～4h，必要時可過夜。
棄去染色液，用蒸餾水把膠面漂洗幾次，然后加入脫色液，進行擴散脫色，經常換脫色液，直至蛋白質帶清晰為止。
5. 結果處理
測量脫色后凝膠板的長度和每個蛋白質樣品移動距離(即蛋白質帶中心到加樣孔的距離)，測量指示染料遷移的距離。
按以下公式計算蛋白質樣品的相對遷移率(Rm)
相對遷移率＝樣品遷移距離(cm)／染料遷移距離(cm)
標準曲線的制作：以各標準蛋白質相對遷移率為橫坐標，蛋白質分子量的對數為縱坐標在半對數坐標紙上做圖，得到一條標準曲線。
測定蛋白質樣品的分子量：根據待測蛋白質樣品的相對遷移率，從標準曲線上查得該蛋白質的分子量。
注意事項
APS和TEMED是促凝的，根據溫度加入的量是可以變動，一般不超過30％。
玻璃板一定要洗干凈，否則制膠是會有氣泡。
聚丙烯酰胺具有神經毒性，操作時注意安全，戴手套。（凝膠以后，聚丙烯酰胺毒性降低。）
凝膠的時間要嚴格控制好，一般在20-30min。
點樣時，如果孔比較多，盡量點在中央。（點在邊上時，跑出的帶是斜的）
點樣前要排盡膠底部的氣泡，防止干擾電泳。
電泳結束后，取膠時，小心把玻璃板翹起（防止再次落下）。
脫色時，盡量多次進行換水。
上樣量不宜太高，蛋白含量每個孔控制在10μg-50μg,，一般＜15μl。
做膠時，凝膠時間控制在25min。梳子需一次平穩插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。
上樣時，Marker，好標在中間，邊上的孔盡量不要上樣。
制膠時，在加APS前盡量不要攪拌，加入APS后可以輕輕攪拌，不要產生氣泡。
分離膠緩沖液的pH一定要準確，盡量在20℃左右調掉8.8
安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲，防止夾壞玻璃板，避免緩沖液滲漏。
凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠。注膠過程，好一次性完成,避免產生氣泡。
微，量注射器（加樣器）上樣時, 注射器不可過低,以防刺破膠體；也不可過高, 樣品下沉時易發生擴散，溢出加樣孔。
剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分。
注意：溫度，時間，光照，APS和TEMED都會對凝膠產生影響