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NADPH-細(xì)胞色素 C 還原酶（NCR）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
閱讀：602 發(fā)布時(shí)間：2020-11-30NADPH-細(xì)胞色素 C 還原酶（NCR）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書
微量法 100 管/96 樣
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
測(cè)定意義：
細(xì)胞色素 P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其
是藥物和毒物的代謝。NCR 作為 P450 酶系的重要一員，催化氧化型 P450 還原再生。
測(cè)定原理：
NCR 催化 NADPH 還原氧化型細(xì)胞色素 C，還原型細(xì)胞色素 C 在 550nm 處有特征吸收峰；
通過(guò)測(cè)定 550nm 吸光度的增加速率，來(lái)計(jì)算 NCR 活性。
自備儀器和用品：
普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔
板和蒸餾水。
試劑組成和配置：
試劑一：粉劑×2 瓶，4℃保存。臨用前根據(jù)用量每瓶加 100mL 蒸餾水充分溶解。
試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。
試劑三：粉劑×1 管，-20℃保存。臨用前配制，加 1.04 mL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。
試劑四：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前配制，加 1100 μL 蒸餾水充分溶解，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約 0.5g 組織，加入 4℃預(yù)冷的 1 mL 試劑一，冰上充分研磨，
10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。
2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心 60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1 mL 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g
離心 30min，棄上清液。
4、終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5 mL，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測(cè)。
NADPH-細(xì)胞色素 C 還原酶測(cè)定操作：
1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 550 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在 37℃水浴中預(yù)熱 30min。
3. 空白管：取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 蒸餾水、180μL 試劑二、10μL 試劑
三和 10μL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 和第 130s 吸光
值。△A 空白管=A2-A1。
4. 測(cè)定管：取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 10μL 提取液、180μL 試劑二、10μL 試劑
三和 10μL 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10s 和第 130s 吸光
值。△A 測(cè)定管=A4-A3。
注意：空白管只需做一次。
NCR 活性計(jì)算公式公式：
a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞色素 C 為 1 個(gè)酶活
單位。
NCR ((nmol/min /mg prot)= (△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T
= 550×(△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞色素 C 為 1 個(gè)酶活單
位。
NCR ((nmol/min/g)= (△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T
=275×(△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷W
ε：還原型細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑（cm），
1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），210μL=2.1×10-4
L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），
需要另外測(cè)定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V 樣總：提取液
體積，0.5 mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min 。
b.使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞色素 C 為 1 個(gè)酶活
單位。
NCR ((nmol/min/mg prot)= (△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T
= 1100×(△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃中，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1μmol 還原型細(xì)胞色素 c 為 1 個(gè)酶活單位。
NCR ((nmol/min/g) = (△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)÷T
= 550×(△ A 測(cè)定管-△ A 空白管)÷W
ε：還原型細(xì)胞色素 C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：96 孔板光徑（cm），
0.5cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積（L），210μL=2.1×10-4
L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），
需要另外測(cè)定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積（mL），10μL=0.01mL；V 樣總：提取液
體積，0.5mL；T：反應(yīng)時(shí)間（min），2min 。
注意事項(xiàng)：
試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的 4℃可保存兩天。