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實驗目的

 

掌握細胞計數的方法。

 

了解區分細胞存活狀態的方法。

實驗用品

 

0.4%臺盼藍溶液、無水乙醇或95%乙醇溶液、脫脂棉

 

普通顯微鏡、試管、吸管、毛細吸管、細胞計數板、綢布。

實驗原理

 

在細胞培養工作中，常需要了解細胞生活狀態和鑒別細胞死活，確定細胞接種濃度和數量以及了解細胞存活率和增殖度，如用酶消化制備的細胞懸液中細胞活力的鑒別，凍存細胞復蘇后的活力檢測等。細胞懸液制備后，常用活體染料臺盼藍對細胞進行染色，進行細胞計數。臺盼藍不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色。而死亡細胞的細胞膜通透性增高，可使染料進入細胞內而使細胞著色（藍色）。細胞計數一般用血細胞計數板，按白細胞計數方法進行計數，便于確定細胞的生活狀況。

 

 

實驗內容與方法

 

（一）制備動物細胞懸液

 

將動物細胞用生物鹽水制備成適當濃度的細胞懸液備用。

 

（二）細胞計數

 

 

1. 計數板處理

 

用無水乙醇或95%乙醇溶液擦拭計數板后，用綢布擦凈，另擦凈蓋玻片一張，把蓋片覆在計數板上面。

 

 

2. 染色

 

用滴管吸取0.4%臺盼藍染液，按1∶1比例加入細胞懸液中。從計數板邊緣緩緩滴入，使之充滿計數板和蓋片之間的空隙中。注意不要使液體流到旁邊的凹槽中或帶有氣泡，否則要重做。稍候片刻，將計數板放在低倍鏡下（10×10倍）觀察計數。

 

 

3. 計數方法

 

按圖計算計數板的四角大方格（每個大方格又分16個小方格）內的細胞數。計數時，只計數完整的細胞，若聚成一團的細胞則按一個細胞進行計數。在一個大方格中，如果有細胞位于線上，一般計下線細胞不計上線細胞，計左線細胞不計右線細胞。二次重復計數誤差不應超過±5%（圖7-1）。鏡下觀察，凡折光性強而不著色者為活細胞，染上藍色者為死細胞。

 

 

4. 計數的換算

 

計完數后，需換算出每ml懸液中的細胞數。由于計數板中每一方格的面積為0.01 cm2，高為0.01 cm，這樣它的體積為0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml＝1000 mm3，所以每一大方格內細胞數×10 000＝細胞數/ml，故可按下式計算：

 

細胞懸液細胞數/ml＝4個大格細胞總數/4×10 000

 

如計數前已稀釋，可再乘稀釋倍數。

 

計數細胞后，計算細胞懸液濃度并求出存活與死亡細胞數的比例。

注意事項：

 

向計數板中滴細胞懸液時要干凈利落，加量要適當，過多易使蓋片漂移，或淹過蓋片則失敗，需重做，過少易出現氣泡；不理想時，應重做；

 

鏡下計數時，若方格中細胞分布明顯不均，說明細胞懸液混合不均勻，需重新將細胞懸液進行混合，再重新計數。如圖7-1：