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細胞的原代培養(yǎng)實驗
閱讀：395 發(fā)布時間：2020-9-26| 實驗方法原理 | 原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細胞進行培養(yǎng)，由于細胞剛剛從活體組織分離出來，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細胞的生長、代謝、繁殖提供有力的手段，同時也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上，加入培養(yǎng)基后進行培養(yǎng)。分散細胞培養(yǎng)則是將組織塊用機械法或化學(xué)法使細胞分散。從胎兒或新生兒的組織分離到活性好的游離細胞，經(jīng)典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細胞間的結(jié)合物，或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細胞互相粘著所依賴的Ca2+，再經(jīng)機械輕度振蕩，使之成為單細胞。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 孕鼠(胚胎小鼠) 新生1～3天乳鼠 |
| 試劑、試劑盒 | 1640培養(yǎng)液 PBS 胰蛋白酶 EDTA混合消化液 乙醇 |
| 儀器、耗材 | 手術(shù)器械 平皿 培養(yǎng)瓶 吸管 離心管 煤氣燈 燒杯 超凈工作臺 二氧化碳培養(yǎng)箱 倒置顯微鏡 |
| 實驗步驟 | 1. 取材 用頸椎脫位法使胎大鼠迅速死亡。然后，把整個動物浸入盛有75％乙醇的燒杯中數(shù)秒鐘消毒，取出后放在大平皿中攜入超凈臺。用消過毒的剪刀剪開用碘酒和乙醇再次消毒后的皮膚，剖腹取出肝臟或腎臟，置于無菌平皿中。
2. 切割 用滅菌的PBS 液將取出的臟器清洗三次，然后用眼科手術(shù)剪刀仔細將組織反復(fù)剪碎，直到成1 mm3 左右的小塊，再用PBS 清洗，洗到組織塊發(fā)白為止。移入無菌離心管中，靜置數(shù)分鐘，使組織塊自然沉淀到管底，棄去上清。
3. 消化、接種培養(yǎng) 吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA 混合消化液1 ml，加入離心管中，與組織塊混勻后，加上管口塞子，37 ℃水浴中消化8～10 分鐘，每隔幾分鐘搖動一下試管，使組織與消化液充分接觸，靜止，吸去上清，向離心管中加入5～10 ml 含10％小牛血清的1640 培養(yǎng)基，用吸管吹打混勻，移入二個培養(yǎng)瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 |
| 注意事項 | 1. 嚴格進行動物皮膚消毒．使用三套器械取材。新生動物皮膚先用2％碘酊液消毒，成年鼠先用3％～5％碘酊液消毒后用75％乙醇消毒。
2. 嚴格進行無菌操作，防止細菌、真菌、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染。
3. 吸取液體前，瓶口和吸管進行火焰消毒；經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷卻。防止燙傷、燙死細胞。吸取液體時，避免瓶口和吸管接觸碰撞。
4. 離心管入臺前，管口、管壁應(yīng)消毒。 |
| 其他 | 來源《中國醫(yī)科大學(xué)實驗指導(dǎo)手冊》《分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)》 |