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大腸桿菌

CaCl2 氨芐青霉素 LB

離心機 分光光度計 搖床

1.  接種一個單菌落于50 ml LB培養液中，于37℃搖床培養過夜（250 r/min）。

2.  往一個2 L 的燒瓶中加入400 ml LB培養液，再加入4  ml 過夜培養液，于37℃；搖床，培養至OD₅₉₀為0.375。

3.  將培養液分裝到8個50 ml 預冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 離心7 min。

4.  細胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl₂溶液重懸，于4℃，以1 100 g 離心5 min 。

5.  細胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl₂溶液重懸，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 離心5 min。

6.  用2 ml  冰冷的CaCl₂溶液重懸各管細胞，然后按每管250 ul 的量分裝于預冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于- 70℃。

7.  按照以下各步驟用10 ng pBR322轉化100 ul 感受態細菌。

8.  將合適體積的轉化物涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養過夜。

9.  將10 ng 加入到一個15 ml 無菌的圓底試管中，并放置冰上。

10.  將盛有感受態細胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。

11.  立即將100 ul 感受態細菌加 入到管中，輕輕旋動，并放置冰上10 min 。

12.  將管故入42℃水浴2 min 進行熱休克，然后加入1 ml LB 培養液于每一支試管中。

13.  于37℃置滾筒式搖床口培養1 h。

14.  將幾個稀釋度菌液涂布于含合適抗生素的平板上，于37℃培養12~16 h。

1.轉化菌涂平板前抗生素的量要足夠，涂布細菌時菌量不要太多，培養時間不要超過16小時。否則抗生素會失效，未轉化菌也會生長。

2.制備感受態細胞的過程中，每一步操作的動作要輕柔，尤其是懸浮細胞時要避免用旋禍混合器。

3.所用的CaCl2等試劑均需是高純度的，并用純凈的水配制，好分裝保存于4℃。

4.整個操作過程均應在無菌條件下進行。