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ELISA實驗常見問題分析
閱讀：507 發布時間：2020-8-7ELISA實驗常見問題分析
異常 | 結果描述 | 原因分析 | 對策 |
白板 | 顯色步驟結束后，酶標板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色。 | 試劑已過效期，或不同試劑盒組分混用 | 檢查試劑的組分及批號，確認未過期以及所有組分均屬對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用。 |
錯加、漏加試劑底物、顯色劑 A或B | 嚴格按說明書的步驟操作，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現象。 | ||
洗板及加樣過程中，酶標受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認配制洗液的容器已洗干凈。 | ||
終止液誤作洗滌液稀釋或當底物緩沖液配制 | 每次配制時都應看清標簽標明物質 | ||
蒸餾水有問題 | 確認配制洗液的純化水達到要求且未污染，與好蒸餾水比較。 | ||
顯色弱、靈敏度低 | 實驗結束后，包括陽性對照、質控在內的所有板孔顏色均較淡。 | 試劑盒超過期， 超過有效期的產品可能會產生很弱的信號； 試劑盒沒有按規定進行保存，受高溫影響； | 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認試劑未過期。 不要將試劑盒長時間置于常溫下，按使用規定儲藏。 |
試劑、樣品用前未平衡至室溫 | 從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應置室溫平衡 20分鐘左右。 | ||
加入試劑的體積和時間有誤， 移液器計量不準，吸嘴內水分太多或不清潔； | 確定所使用的試劑體積正確，加入時間適當。 校正移液器，移液器與吸嘴配合要緊密吻合。移液不宜太快，排放應*。 | ||
洗板及加樣過程中，酶標受污染失活而失去催化顯色劑顯色的能力 | 確認盛酶標的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認配制洗液的容器已洗干凈，確認配制洗液的純化水達到要求且未受污染。 | ||
孵育時間及孵育溫度未達到要求 ，反應板放入培養箱時注意溫度并及時調整。 | 孵育溫度應控制在 37-38℃，孵育時間嚴格按照說明書操作。 保溫期內不宜多開門，以免影響保溫。 | ||
洗板次數過多，或濃縮洗液稀釋倍數不符合要求；洗滌沖擊力太大。浸泡時間太長； | 嚴格按說明書要求稀釋濃縮洗液及洗板，減小洗滌沖擊力，按說明書要求置留洗滌液時間和洗滌次數。 | ||
顯色劑加量不足或順序顛倒，或混合后加入； | 顯色劑滴瓶垂直向下，持力均勻，滴速不宜過快，先加顯色劑 A，后加顯色劑B，不可將A、B液混合后加入 | ||
底物作用時間不夠； | 準確定時。 | ||
蒸餾水水質有問題； | 測定蒸餾水配制試劑對酶免疫法的影響。 | ||
實驗結束后，陰陽性對照正常，質控正常，但臨床標本感覺顯色較弱 | 待測標本中可能不含強陽性標本，故結果可能是正常的 | 如有懷疑，可復檢 | |
標本加入疊氮鈉作為防腐劑 | 酶免實驗中的標本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用 proclin、硫柳汞等其他防腐劑 | ||
陰陽性對照正常，但質控、參考品或個別弱陽性標本未能檢出。 | 未達要求的孵育溫度及孵育時間可檢出強陽性標本，但 質控或弱陽性標本受 溫度變化影響較大而被未檢出 | 質控品或標本避免反復凍融。標本在一周內使用的，可存于 2-8℃，如需長期保存，應置于-20℃以下保存。質控品應小量分裝，并置于-20℃以下保存。 | |
質控品或標本高溫放置過久，或被反復凍融致待測物滴度下降，而未能檢出 | 重新設定酶標儀的參數，特別是檢查濾光片是否匹配。 | ||
儀器設定不正確，濾光片不匹配 | 重新設定酶標儀的參數，特別是檢查濾光片是否匹配 | ||
靈敏度過高、板底高、高背景 | 終止后，整板結果顯現均一的黃色或淡黃色；或陰陽性對照、質控正常，標本陰性標本 OD值過高。 | 整板的黃板現象可能是由于錯加其他試劑造成，如同時操作兩對半試劑時，測 HbsAb板用于測HBsAg等； | 實驗前檢查試劑的組分及批號，確認所有組分均屬于對應的試劑盒。不同試劑盒或不同批號的試劑不能混用 |
酶標對吸頭的污染以及對盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現象； | 避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈 | ||
顯色劑在光照條件下放置過久，實驗前已變藍 | 顯色劑 A、B未使用前避光保存 | ||
孵育溫度過高或孵育時間過長； | 孵育溫度應控制在 37-38℃，孵育時間嚴格按照說明書操作。 | ||
未按要求洗板。特別是洗滌時每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現象 | 嚴格按說明書要求洗板 | ||
花板，一般是由于臨床標本的收集、處理和保存方法不當造成 | 放置時間（自然放置 1~2h）及離心轉速（3000r/min）、離心時間（15min）應引起注意。 | ||
出現隨機性的花板、跳孔現象 | 樣品離心不*，反應孔內發生凝血或殘留細胞成分； | 充分離心， 3000rpm6分鐘以上。 | |
加樣時交叉污染； | 加標本時盡量 避免交叉污染。如盛標本的試管周圍常有血痂，易脫落，應遠離酶標板。 | ||
手工洗板造成的交叉污染 | 手工洗板時前 3次注洗液后應立即棄去，后幾次再設定浸泡時間，可減少交叉污染 | ||
洗板機加液頭堵塞導致加液不滿或吸液殘留量較大，造成 花板、跳孔 | 疏通加液頭，使洗板時每孔均注滿洗液，吸液時殘留量要小。 | ||
拍板時交叉污染 | 洗板完畢拍板時用合適的吸水紙巾，不要把無關物質拍進板孔，并盡量不要在同位置拍，以免交叉污染。 | ||
假陽性 | 假陽性現象是一個綜合現象，可參考上文 “靈敏度過高、板底高、高背景” 中的分析。這里只列舉常見的原因及對策。 | 計算 Cutoff值時使用的公式不正確，導致計算得出的CutOff值過低，從而導致出現假陽性 | CutOff值計算公式應嚴格參照所屬產品的說明書，應注意各個酶免產品的Cutoff值計算公式不盡相同 |
洗板時未能注滿洗液或洗板次數、浸泡時間不夠， 洗滌不充分，樣品中有其他成分殘留 導致花板、跳孔，假陽性增多 | 嚴格按說明書要求洗板。調整洗板機時，應注意有時儀器標示的液量與實際液量并不相符，應根據實際情況調整至每孔注滿。 | ||
血清標本處理不當，如未除去細胞成分、纖維蛋白原及其它干擾物可出現孔底由變藍的跳孔現象，此標本重復實驗結果往往是陰性； | 放置時間（自然放置 1~2h）及離心轉速（3000r/min）、離心時間（15min）應引起注意 | ||
廠家試劑質量的變化造成 | 國家標準要求提高靈敏度時，廠家試劑靈敏度也相應提高，假陽率常常有所上升，但只要在合理范圍，是可以接受的 | ||
水質問題 | 防止蒸餾水污染 | ||
加酶量過多（如 50uL誤認為100uL）或丙肝酶稀釋時加量過多 | 加酶前檢查移液器調節量是否準確，稀釋酶時思想要集中 | ||
培養箱溫度超過 37℃</ |