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細胞原代培養實驗之胰酶消化法
閱讀：1087 發布時間：2019-9-18實驗方法原理 將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實際上，通常把代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。常用的原代培養有組織塊培養和分散細胞培養。
實驗材料 胎鼠新生鼠
試劑、試劑盒 1640培養基牛血清胰酶Hank’s液碘酒
儀器、耗材 培養箱培養瓶青霉素瓶小玻璃漏斗平皿吸管移液管紗布手術器械血球計數板離心機水浴箱
實驗步驟
一、實驗材料準備
1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g，KCl 0.4 g，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g，加H2O至 1 000 ml。Hank's液可以高壓滅菌。4℃下保存。
二、具體操作
1. 將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。
2. 用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
3. 用手術剪將肝臟剪成小塊（1 mm2），再用Hank's液洗三次，轉移至小青霉素瓶中。
4. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。
5. 加入3-5 ml培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
6. 靜置5-10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
7. 1 000 rpm，離心10分鐘，棄上清液。
8. 加入Hank's液5 ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
9. 加入培養液1-2 ml（視細胞量），血球計數板計數。
10. 將細胞調整到5x105/ml左右，轉移至25 ml細胞培養瓶中，37℃下培養。
收起
注意事項
1. 自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
2. 在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。
3. 凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。
4. 操作前要洗手，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
5. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，并冷卻后才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
6. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會。
7. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理。
8. 瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。