一、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。 - 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
- 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
- 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
- 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
- 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備 - 如果有N個樣品，設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
- 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數細菌DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的細菌DNAout或柱式細菌DNAout。本試劑盒免費贈送50次免DNA提取的天凈沙DNA釋放劑，本產品的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟。
三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行） - 如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于標準曲線樣品。
- 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標準曲線 樣品管（2-7管） | 2×Probe qPCR MagicMix（本色蓋） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌 qPCR探針（綠蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌 PCR引物混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…） |
過程 | 溫度 | 時間 | 預變性 | 94℃ | 5 min | PCR反應 （40個循環） | 94℃ | 0.5 min | 50℃ | 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號） | 72℃ | 0.5 min | 后延伸 | 72℃ | |
五、數據處理 - 以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
六、電泳檢測 - 如果有必要電泳確認，可取10-20μL PCR產物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產物的大小為400 bp。但電泳非常容易污染實驗環境，建議不輕易采納。
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